我们通过药物乌头碱诱发家兔心律失常，利用 RT-PCR 法检测不同组别的家兔心脏 M3受体mRNA 的 表达变化 ， 探讨针刺及艾灸对 M3受体mRNA 表达的调节作用， 为针刺和艾灸治疗心律失常提供实验依据。
1、 材料与方法
1.1 实验动物 新西兰家兔，雄性，3～4 月龄，体质量 2～3 kg，清洁级，上海生旺实验动物养殖有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0007。
1.2 主要试剂 乌头碱（中国药品生物制品检验所，批号：110720-200410）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司，批号：20060323）；总 RNA 提取试剂盒、RT 试剂盒（美国 Invitrogen 试剂公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成； PCR 试剂盒（中国 Tiangen 公司）。
1.3 主 要仪器 PTC -200 PCR 仪 （ 美 国 ABI 公司）；RM6240B 多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）；AllegraTM64R 低 温 高速离心机 （ 美国Beckman 公司）；DYY-III2 水平电泳仪 （北京六一仪器厂）；DU530 紫外分光光度计 （美国 Beckman公司）；ZF-90 紫外透射仪 （上海顾村电光仪器厂）；GENE GENIUS 生物成像系统 （美国 Syngene公司）；BCM-1000 超净工作台 （苏州净化设备有限公司）。
1.4 方法
1.4.1 动物分组 新西兰家兔 40 只，随机分为对照组、药物组、针刺内关穴组、艾炙组 4 组，每组10 只 。 每 组家兔腹腔注射乌来糖 1.1 g ／ kg 麻 醉后，用标准肢体Ⅱ导联连接，连续记录心电。 药物组：耳缘静脉注射乌头碱 25 μg／kg；对照组：耳缘静脉注射等容量的生理盐水；针刺内关穴组：耳缘静脉注射乌头碱 25 μg／kg 后，电针内关穴，电针 20 min，频率 3 Hz，变频 10 Hz，强度以家兔能够耐受，保持安静，不引起挣扎为度；艾灸组：耳缘静脉注射乌头碱 25 μg／kg 后，在内关穴用特制固定器点燃艾条， 在所取范围往返温和熏灸， 艾条与穴位距离以家兔能耐受为度，艾灸时间 20 min。
1.4.2 心 肌组织 M3受体 mRNA 表达的检测 4组家兔 24 h 后处死， 迅速取下左心室， 剪成 1cm×1 cm。 用总 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，利用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳分析其质量， 并用紫外分光光度计测定其纯度和含量。 取 3 μg 总RNA 进行逆转录反应， 取 3 μL 逆转录反应产物进行 PCR 反应。 引物：M3上游引物：5’-GGTGT-GATGATTGGTCTGGC -3’， 下 游 引 物 ：5’ -TTC-CAACTGTCACTGCTGCT-3’，扩增片段为 458 bp。
同时设置 β－actin 为内参，上游引物：5’- CTCAT-GAAGATCCTCACCGA-3’，下游引物 ：5’-ATCTC-CTTCTGCATCCTGTC -3’， 扩 增 片 段 为 387 bp。PCR 反应条件为： 预变性 94℃ 3 min， 94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min， 循环 30 次后，72℃末端延伸 10 min。 PCR 产物上样于 1.2% 的琼脂糖凝胶进行电泳，UV 照相和密度扫描。
1.5 统计学处理 数据用 x±s 表示，用 SPSS 15.0统计学软件进行处理， 不同组间的数据用单因素方差分析和 LSD 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2、 结 果
2.1 模型制备 模型组耳缘静脉注射乌头碱 25μg ／ kg，观察心电图的变化，记录心律失常的发生情况。
2.2 电针干预对家兔心肌 M3受体 mRNA 表达的影响 表 1。 结果显示，与正常对照组比较， 药物组 M3受体的 mRNA 表达明显增加，针刺内关穴后，M3受体的 mRNA 表达与药物组比较有明显降低，P＜0.05。
2.3 艾灸干预对家兔心肌 M3受体 mRNA 表达的影响 表 2。 结果显示，与正常对照组比较， 药物组 M3受体的 mRNA 表达明显增加，P＜0.05。 艾灸组与药物组比较，M3受体的 mRNA表达有明显降低 P＜0.05， 但较针刺内关穴组，M3受体的 mRNA 表达有所升高，差异不显著。
3、 讨 论
3.1 心律失常的病因复杂，可由多种因素引起心肌电生理的异常。 乌头碱能直接兴奋心肌， 激活Na+通道，促进 Na+内流，对 L 型 Ca2+通道也有明显的通透作用，加速细胞膜的去极化，提高心房传导组织和房室束-浦肯野系统等快反应细胞的自律性，这是乌头碱致心律失常的主要机制。 心脏在交感神经和副交感神经的精细控制下完成正常的生理功能，心脏迷走神经通过刺激 M 型乙酰胆碱受体，调节心脏收缩力、兴奋性和传导。 近些年发现，M3受体不仅具有负性肌力和负性频率的作用，还可以介导一种新的钾电流，并且在充血性心力衰竭、 缺血性心律失常等疾病的发生发展中发挥着重要作用。 目前，越来越多的证据表明，心脏M3受体是一种新型的抗心律失常药物靶点。 研究表明 M3受体在病理状态下和生理状态下的功能性表达是不同的。 Shi H 等分别在充血性心力衰竭犬的心房肌细胞和健康犬的心房肌细胞上，通过 Western blotting 比较 M3受体的密度，全细胞膜片钳技术比较 M3受体激动的延迟整流钾电流（IKM3）的电流密度，发现 M3受体密度和 IKM3的电流密度在充血性心力衰竭犬的心房肌细胞上明显增加。 由此可见，心肌 M3受体在病理状态下，功能性表达明显增加。 宋娟等研究也发现乌头碱诱发心律失常后， 大鼠心肌 M3受体 mRNA 的表达增强。 本实验通过乌头碱诱发新西兰家兔心律失常后， 通过半定量 RT-PCR 法检测 心脏 M3受体mRNA 的表达变化，结果也发现心肌 M3受体 mR-NA 的表达增强。
3.2 内关穴是手厥阴心包经的络穴，又是八脉交会穴，通阴维脉；心包经和手少阳三焦经相表里，故针刺内关可以通三焦，调诸脏。 心居上焦，亦受其调节。 所以，针刺或艾灸内关穴对心律失常有调整作用。 与临床常用的抗心律失常药相比，针刺和艾灸具有使用安全、费用低廉、副作用小的优点。
本实验结果表明针刺内关穴组的 M3受体 mRNA表达较药物组低，艾灸组的 M3受体 mRNA 表达也较药物组低， 证实了针刺或艾灸内关穴可以在一定的程度上降低 M3受体的表达，提示针刺或艾灸内关穴治疗心律失常与 M3受体的参与有关。
参考文献：
［1］ 王 丽娟 ，吕爱红. 救 治急性乌头碱中毒探讨及体会 ［J］. 医 药论坛杂志，2011，32（23）：141-142.
［2］ 栾 海蓉 ， 李海林 ， 何志鹏 ， 等 . M3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响［J］. 医学综述，2012，18（15）：2496-2498.
