广西巴马县是长寿之乡，本课题组之前曾探讨过 DNA 甲基化水平与巴马长寿的相关性，发现巴马人群和对照组的总体甲基化水平都呈增龄性下降，年龄与甲基化比值呈负相关，巴马县人群的 DNA 总体甲基化水平比对照组人群高，提示巴马长寿现象可能与该地区人群较高的 DNA 总体甲基化水平有关.本文在前期研究的基础上，借鉴 DNA 混合池研究基因甲基化的方法,寻找与广西巴马长寿相关的超甲基化位点和基因，进一步探讨 DNA 甲基化与巴马长寿的关系。
1 材料与方法
1. 1 研究对象 在广西巴马县长寿家族中选取 60 例 90 ~ 110岁老人组成长寿组，在非长寿家族中选取 48 ~ 85 岁的健康者60 例组成对照组。
1. 2 主要仪器 紫外分光光度计（Eppendorf Biophotom） ,Hy-bridization system12 杂交仪（Roche-NimbleGen） ,MS200 扫描仪（Roche-NimbleGen） .
1. 3 方法
1. 3. 1 基因组 DNA 制备及混合池的构建 根据“知情同意”的原则抽取研究对象外周静脉血 2 ml,提取基因组 DNA.参考Barcellos 等〔3〕的方法，构建四个 DNA 混合池： ①30 例有长寿家族史的 100 ~110 岁老人，男 5 例，女 25 例； ②30 例有长寿家族史的 90 ~99 岁老人，男 4 例，女 26 例； ③30 例无长寿家族史的48 ~ 75 岁健康对照者，男 5 例，女 25 例； ④30 例无长寿家族史的76 ~85 岁健康对照者，男6 例，女24 例。用紫外分光光度计测量每个 DNA 样品浓度各 3 次，取平均值，再将样品稀释到终浓度为 100 ng/μl,从同一组的 30 个 DNA 样品中各取 5 μl 混合，分别构建 4 个 DNA 混合池。前两个混合池为长寿组，后两个混合池为对照组，长寿组与对照组性别分布无显著差异。
1. 3. 2 Roche-NimbleGen MeDIP.
1. 3. 2. 1 基因组 DNA 片段化 用 MseI（NEB,R0525S） 将基因组 DNA 消化过夜，然后用 QIAquick PCR Purification Kit （Qia-gen,28104） 纯化片段化的 DNA,最后用分光光度计定量，并结合琼脂糖凝胶电泳质检。
1. 3. 2. 2 免疫沉淀甲基化的 DNA 将能与甲基化的 DNA 片段发生特异性反应的 momoclonal mouse anti-5-methylcytidine 抗体（Abcam,Ab10805） 与消化后的 DNA 孵育过夜。利用羊抗鼠IgG（Dynal,112-01D） 将 DNA-抗体复合物沉淀，清洗回收后用蛋白酶 K（NEB,P8102） 消化过夜，采用酚抽提、乙醇沉淀法回收 DNA.
1. 3. 2. 3 DNA 扩增标记 （1） 取上述免疫沉淀后的 DNA Me-DIP,采用 WGA2 Kit （Sigma,WGA2-50RXN） 扩增，利用 QIA-quick PCR Purification Kit 纯化扩增后的产物，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及定量。（2） 取上述扩增产物，利用荧光标记的随机引物进行 klenow 酶（NimbleGen Dual-Color DNA Labe-ling Kit,05223547001） 反应标记，标记产物用异丙醇沉淀浓缩并定量。
1. 3. 2. 4 杂交与清洗、芯片扫描 将标记好的样品 MeDIP 与Roche-NimbleGen 提供的杂交液配成合适体积，然后与芯片杂交，采 用 Roche-NimbleGen 的 Hybridization system12 杂 交 仪42℃ 杂交过夜。最后分别用洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干后在 Roche-NimbleGen MS200 扫描仪行扫描分析。
1. 3. 2. 5 芯片图像的采集与数据分析 通过 5-甲基胞嘧啶抗体进行免疫沉淀、捕获富集甲基化的 DNA 片段。采用 Nim-bleScan 进行图像分析，将图像信号转化为数字信号，根据实验样品（IP） 和对照样品（input） 之间的探针信号比值，用 Kolmog-orov-Smirnov 检验计算 P 值，P < 0. 01 视为甲基化程度较高的序列。
1. 4 差异甲基化基因的功能注释 在分子注释系统（MAS,ht-tp: / / bioinfo. cap-Italbio. com / mas） 上对差异甲基化基因的功能进行注释。
2 结 果
2. 1 差异甲基化的筛选 利用芯片技术、根据 P<0. 01 的判断标准，共筛查出 6 441 个超甲基化位点，甲基化值 0. 6 ~1. 0,其中长寿组 392 个，发生在甲基化岛的位点有 189 个； 对照组6 049个，发生在甲基化岛的位点有 2 407 个，长寿组和对照组发生在甲基化岛的超甲基化位点数比例分别占各组位点总数的 48. 2% （189/392） 和 39. 8% （2 407/6 049） .超甲基化位点共涉及 1 618 个基因，长寿组比对照组甲基化程度高的基因有133 个，存在 CpG 岛的基因有 75 个，占 56. 3% （75 /133） ,共形成 160 个 CpG 岛； 而对照组比长寿组甲基化程度高的基因有1 485个，存在 CpG 岛的基因有 640 个，占 43. 1% （640 /1485） ,共形成 1 268 个 CpG 岛。
2. 2 长寿组超甲基化基因分析
2. 2. 1 长寿组超甲基化基因的功能注释 将 133 个超甲基化基因数据输入在线芯片 MAS 进行 GO（gene ontology） 分析，发现该组133 个超甲基化基因主要涉及24 种生物学功能，见表1.
2. 2. 2 长寿组超甲基化基因涉及的通路 将 133 个超甲基化基因输入 MAS 在线分析软件，利用其中的 KEGG 数据库进行分析，结果表明，该 133 个超甲基化基因共涉及 42 个通路。q值越小，数据的可信度越高。表 2 中列举了排位前 20 位的通路、涉及的基因数目及名称。
2. 3 对照组超甲基化基因分析
2. 3. 1 对照组超甲基化基因的功能注释 将 1 485 个超甲基化基因数据输入芯片 MAS,发现该组1 485个超甲基化基因主要涉及 24 种生物学功能，见表 3.
2. 3. 2 对照组超甲基化基因涉及的通路 将 1 485 个超甲基化基因输入 MAS 在线分析软件，利用其中的 KEGG 数据库进行分析，结果表明，该 1 485 个超甲基化基因共涉及 156 个通路。表 4 中列举了排位前 30 位的通路及其涉及的基因数目。
2. 4 超甲基化基因与疾病的关系 超甲基化基因涉及的疾病众多，见表 5.同时，单个基因也可能与多种疾病有关联。
2. 5 超甲基化基因与其编码的 miRNA 长寿组中有 113 个超甲基化基因编码了 476 个 miRNA; 对照组中有 1 073 个超甲基化基因编码了 478 个 miRNA,两组超甲基化基因共同编码的miRNA 有 476 个，包括 miR-103、miR-107、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496 等。对照组超甲基化基因比长寿组多编码的两个 miRNA 是 miRNA-487a 和 miRNA-587.
3 讨 论
3. 1 DNA 甲基化与衰老的关系 DNA 甲基化是指在甲基转移酶的催化下，CG 两个核苷酸中的胞嘧啶第 5 位碳原子被加上一个甲基基团、形成 5-甲基胞嘧的过程。甲基化模式很不稳定，受衰老、疾病、理化等因素的影响而发生改变。某些基因的异常甲基化与衰老有密切的关系。已有研究表明早衰症与 LM-NA、WRN 基因突变有关，当基因突变同时伴有异常 DNA 甲基化时，将能增强发生该病的可能性，即基因突变与 DNA 甲基化在该病的发生过程中起到协同的作用〔4〕.
在 Davide 等〔5〕的研究中发现，与非长寿家族后代比较，长寿老人的后代发生增龄性总体甲基化水平下降并不明显，其下降速度较前者慢，且总体甲基化程度较前者高。年龄相仿的两个后代组人群间比较，有长寿家族史的后代在屡患慢性疾患、接受药物治疗、处方药使用频率等方面较没有长寿家族史的后代少，表明该群体整体健康状况更好。在两群体间还筛选获得有统计学差异的超甲基化位点，发现这些位点所在的基因涉及DNA 或 RNA 合成、代谢、细胞信号通路等生物学过程。以上发现提示，长寿家族的后代可能保留了更好的甲基化模式，能增强基因组和转录系统的稳定性，因此能推迟或延缓后代人群某些年龄相关慢性疾病的发生，达到延长寿限的目的。
DNA 甲基化与年龄有关，甲基化岛会发生增龄性甲基化水平升高，而非甲基化岛的情况却恰恰相反，即存在增龄性甲基化水平降低的趋势。位于启动子区的 CpG 岛发生甲基化时，往往会导致该基因表达下调，DNA 甲基化程度越高，基因转录活性越低，反之，甲基化越低，基因表达越高〔6〕.本研究发现巴马长寿现象与 DNA 甲基化关系密切，并发现与长寿呈正相关和负相关的超甲基化位点和基因。巴马地区人群的长寿现象是否归因于系列疾病相关基因 CpG 岛发生了超甲基化，导致基因表达受抑制，从而使人群免受疾病而延长了寿限？ 这还需要以具体的疾病相关基因进行深入的验证。
3. 2 生物学功能与衰老的关系 两组人群的超甲基化基因均涉及 24 个生物学功能，且均以细胞过程、生理过程、生物调控为主，提示两组人群的衰老生物学基础是相同的。有研究表明，衰老与炎症反应有关联，在随访 9 年的健康人群中发现，随着年龄的增长，20% 以上的个体体内的炎症物质 C-反应蛋白（CRP） 和白细胞介素（IL） -6 浓度双倍增长，令人群屡患年龄相关的心血管疾病的危险度和发生死亡结局的风险增加〔7〕.年龄相关的神经元退行性病变与 RNA 氧化损伤有关，在只出现了轻度认知损伤阶段、还没达到阿尔茨海默病（AD） 临床前期时，在神经元中已能检测到 RNA 的氧化产物 8-羟基鸟苷。与年龄匹配的对照人群比较，最终会发展为 AD 的病例中能检测到更高水平的 8-羟基鸟苷〔8〕.端粒是染色体终端结构，对染色体末端起着保护作用。端粒的长度随着细胞的不断分裂而缩短，其 DNA 丢失到一定程度时，细胞随之发生衰老和死亡。本课题组之前的研究也表明，巴马长寿与端粒的长度有关〔9〕.
3. 3 信号传导通路与衰老、长寿相关性 生物性衰老过程会同时伴随着单细胞水平自然杀伤细胞的细胞毒活性下降，但在健康老人及百岁老人中，细胞毒活性却得到很好的保存，并可持续其一生，这可能是有助其达到高龄及百岁的原因〔10〕.本研究发现，在长寿组中有 4 个高甲基化基因 NFATC1、RAET1G、SHC2、ULBP1 落在自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路上，而对照组则有 BID、ITGB2、NFATC1 等 11 个高甲基化基因落在此通路，说明自然杀伤细胞介导细胞毒性机制能影响巴马长寿现象，推测是由于相关基因发生超甲基化后，导致其转录活性降低，从而其相关基因表达下调，抑制自然杀伤细胞的活性，进而影响机体的免疫能力。长寿组人群只有较少相关基因发生甲基化，故保存有较强的免疫功能，从而寿命得以延长。
同样，丝裂原活化蛋白激酶信号通路也参与衰老调控。在动物实验中发现 C-美丽线虫的免疫衰老现象与丝裂原活化蛋白激酶信号通路 PMK-1 p38 活性下降有关〔11〕.分析对照组人群寿限较长寿组短的原因，可能与通路上较多相关基因发生甲基化、导致基因表达活性进一步下降有关。
在线虫、果蝇和小鼠的研究中发现减少胰岛素样多肽可以延缓生物的衰老从而使其增加寿命〔12〕.在哺乳动物的研究中也发现胰岛素和胰岛素生长因子可以影响生物的衰老过程〔13〕.本次研究亦发现了长寿与胰岛素转导通路有关。推测对照组的多个胰岛素信号通路相关基因甲基化后，降低了基因转录活性，进一步地加速组织衰老，而长寿组仅有 2 个基因出现高甲基化状态，故可延缓衰老、增加寿命。
3. 4 差异超甲基化基因与疾病的关联 在本次研究中，不管是长寿组还是对照组均存在与年龄相关疾病有关联的差异超甲基化基因。有意思的是，在长寿组中与长寿有关的基因无一发生甲基化，对照组中却有 ACSL1、C4A、CBS、CNN1、ETFA、HS-PA1L、SERPINE1 等基因处于超甲基化状态，以上基因与脂质代谢、补体系统功能、免疫功能、皮肤胶原合成有关〔14 ~16〕.一个基因可与多种疾病有关联，长寿组中 CCKBR、COL18A1、EGR3、H19、IL11、TIMP-1、S100A1 等超甲基化基因涉及几十种疾病，以肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病为主，有些基因与疾病的关系已在人群研究中得到验证，如 TIMP1 基因与人类皮肤衰老、S100A1 基因与肾脏肿瘤的关系.疾病相关基因发生甲基化后，其转录活性下降，使人群不易屡患相应疾病。对照组中也存在与数十种疾病相关的基因 ACSL1、ATP5I GCK、AD-CY8 等，以自身免疫性疾病、结缔组织病、代谢紊乱性疾病多见。GCK 基因的失活与糖尿病的关系已得到证实，甲基化的ADCY8 基因是诊断早期胃癌的生物标志物，且此成果已取得了专利。由此可知，对照组人群中的特异性基因发生超甲基化失活后更容易出现相应的疾病，致使该人群的健康水平下降，不易维持健康状态或达到长寿。
3. 5 超甲基化基因编码的 miRNA 与衰老的关系 miRNA 的表达水平与衰老的关系已得到不少实验研究的验证，并发现了许多衰老相关的 miRNA,如 miR-103、miR-107、miR-130a、miR-155、miR-24、miR-221、miR-496 等，其表达水平会随着年龄的增长而下降。此外，受 miRNA 调控的靶基因有 PI3K、c-Kit、H2AX 等，靶基因的表达水平却会随着年龄的增长而升高.
据文献报道，PDZD2 基因对胰岛素的产生以及胰岛 β 细胞的存活起到调节的作用，BMP3 基因启动子甲基化与人胃癌发生有关,以上靶基因在两组人群中的表达情况有待深入研究。
