现代许多临床研究已表明,人类血小板抗原(HPA)所导致的血小板同种免疫与新生儿同种免疫性血小板减少症 ( NATP)、血 小 板 输 注 无 效(PRT)、输血后紫癜(PTP)、移植相关血小板减少症、动脉血栓性疾病等相关[1,2].而不同人群中的HPA 抗原的分布频率是与获得 HPA 免疫机会正相关的,本文选择云南省独有的阿昌族为研究对象,与云南汉族为对照,采用目前 HPA 基因分型最常用的PCR-SSP 技术,对不同人群中 HPA 基因及基因型频率的分布情况作对比分析,探讨血小板抗原多态性与地区、民族的关系,建立云南少数民族地区的血液资源的血小板基因资料库,同时有助于探讨少数民族的起源、遗传、迁移及为法医个体识别提供数据.
1 对象与方法
1. 1 研究对象 2011 ~ 2012 年,采集分布在滇南地区的阿昌族健康人群 139 例,昆明地区健康汉族人群 150 例,所有样本追溯三代无与其他民族通婚史,彼此间无血缘关系,对所有选取对象均履行伦理知情告知,并自愿参加.
1. 2 标本 每人抽取 EDTA-K2 抗凝静脉血 2 ~ 3ml,- 80℃ 冻存待检.
1. 3 仪器与试剂 PCR 扩增仪、水平电泳仪:美国Bio-Rad 公司,凝胶成像系统:Bio-Rad 公司 Gel DocEQ 凝胶成像系统.血小板抗原基因分型试剂盒:长春博德生物技术有限公司.
1. 4 DNA 提取 采用碘化钾法,用紫外分光光度计测定提取的基因组 DNA 的紫外吸收峰,分别在波长 260 nm、280 nm 测定吸光度,用公式计算 DNA 浓度、纯度.统一稀释成 1 μg/μl 于 -20℃储存.
1. 5 HPA 基因分型试验 包括 PCR 引物混合物(序列特异性引物 0. 4 μmol/L,内对照引物 0. 4μmol/L)、10 × PCR Buffer 5μl、dNTP 0. 2 mmol/L,Taq 酶 0. 75 U 和基因组 DNA 1 μg,在同一条件下对HPA1 ~ 17 系统同时进行 PCR 扩增.PCR 反应条件: 94℃、9 min; 94℃、1 min; 61℃、1 min;72℃、1min;共 35 个循环;最后 72℃,10 min.
1. 6 扩增产物的检测 PCR 产物 10 μl 在 2% 琼脂糖凝胶(含 0. 5 mg/L 溴化乙锭)中电泳,80 mV 电压,30 min 结束电泳,凝胶成像系统观察并记录结果.
1. 7 统计学处理 采用 SAS9. 3 统计软件,进行 χ²检验.不同人群间基因频率的比较进行 χ²检验(精确概率法),基因型之间的比较采用χ2检验的多个构成比的比较.以 P < 0. 05 为有差异,P < 0. 01 为有显着性差异.
2 结果
2. 1 阿昌族 HPA1 ~ 17 系统基因检测及统计结果139 例阿昌族人群 HPA1-17 系统基因检测结果见表1,图1 为阿昌族人群 HPA1 ~17 系统基因分型的凝胶成像图:阿昌族人群中 HPA-7、HPA9 ~ 14,HPA-16 抗原系统的基因型均为 aa,未检测出相应的等位基因 HPA-b;HPA-1,2,4,5,6,8,17 抗原系统的基因型以 aa 居多,HPA-3,15 具有较高的杂合度,HPA-3aa、3ab、3bb 的基因型频率分别为 31. 65% 、48. 2% 、20. 15%,HPA-15aa、15ab、15bb 的基因型频率分别为 35. 25%、36. 69%、28. 06%.经 χ²检验,阿昌族人群样本的基因检测结果符合 H-W 遗传平衡定律.
2. 2 汉族组人群 HPA1 ~ 17 系统基因和基因型频率分布 150 例汉族人群中 HPA7 ~14,HPA16,17 抗原系统的基因型均为 aa,未检测出相应的等位基因HPA-b;HPA1,2,4,5,6 抗原系统的基因型以 aa 居多,HPA3,15 具有较高的相同的杂合度,其 aa、ab、bb 的基因型频率分别为 34% 、46. 67% 、19. 33% ,结果见表 2.
2. 3 阿昌族与汉族人群间基因频率的比较 两个民族的 HPA-7,HPA9 ~ 13,HPA-14,16 系统的基因型均为 aa,均未检测出相应的等位基因 HPA-b;两个民族的 HPA-3 与 HPA-15 均具有较高的多态性;与对照组(汉族)人群比较,阿昌族 HPA-1a 系统有差异(P <0. 05),结果见表 3.
3 讨论
现代许多临床研究已表明,人类血小板抗原(HPA)所导致的血小板同种免疫与新生儿同种免疫性血小板减少症 ( NATP)、血 小 板 输 注 无 效(PRT)、输血后紫癜(PTP)、移植相关血小板减少症、动脉血栓性疾病等相关、对此类疾病的诊断、预防和治疗均需以血小板同种抗原的基因分型为基础.
云南省汇集了全国最多的少数民族,少数民族间进行血液输注的可能性非常大,故非常有必要进行其他少数民族 HPA 基因多态性的研究,特别近年来部分少数民族人口数量下降,对于保存其民族遗传学和人类学资料也具有重要意义;目前国内外对HPA 研究可见报道,其中,国内目前对汉族人群的HPA 研究较多[3,4],少数民族 HPA 研究报道甚少[5,6],而云南省少数民族血小板同种抗原的研究尚未见报道[7].
本文以云南省特有的少数民族阿昌族为研究对象,对不同人群中 HPA 基因及基因型频率的分布情况作对比分析,探讨血小板抗原多态性与地区、民族的关系,研究结果显示:从 HPA 基因分型结果可看出(见表 1 ~ 3),云南地区阿昌族健康人群中的HPA1 ~ 17 基因频率与同地区的汉族接近,也呈现各自自身的特点.两个民族的 HPA-7、HPA9 ~ 13、HPA-14,16 系统的基因型均为 aa,均未检测出相应的等位基因 HPA-b;两个民族群样本的 HPA1 ~ 6、HPA-8,13,15,17 系统中 a 的基因频率均大于50%;阿昌族与汉族人群的 HPA-3 与 HPA-15 系统均具有较高的多态性,明显较其他系统具有较高遗传多态性,通过对 MP 值的计算发现,HPA-3、15 系统易发生因为错配输注产生同种免疫反应.阿昌族HPA-1a 基因频率与汉族人群相比差异有统计学意义.因此,为提高血小板输注的安全性和有效性,应高度重视 HPA 同种免疫作用,同时关注是否存在不同民族之间血小板抗原基因差异而导致的免疫作用.根据本次调查的 HPA 基因多态性频率,可以预测阿昌族人群发生血小板同种免疫的风险,在临床上,HPA-1a、HPA-3 与 HPA-15 为具有重要意义的血小板抗原系统.对少数民族进行 HPA 分型,可对预防和诊断由 HPA 同种免疫所造成的疾病,建立少数民族地区血小板供者库提供依据.HPA 作为人类遗传多态性标记,还可应用于法医个体识别,人类进化与迁徙,以及某些疾病相关性的研究.
参考文献:
[1] Santoso S,Kiefel V. Human platelet alloantigens[J]. Wien KlinWochenschr,2001,113:806-813.
[2] 赵桐茂. 人类血小板抗原( HPA) 研究概况[J]. 中国输血杂志,2004,17(2):129-132.
[3] 陈扬凯,叶 欣,夏文杰,等 . 血小板特异性基因(HPA-1-17)在广州地区人群中分布的多态性研究[J]. 中国免疫学杂志,2010,26(8):699-702.
[4]Hurd CM,Cavanagh G,Schuh A,et al. Genotyping for platelet-specific antigens. techniques for the detection of single nucleotidepolymorphisms[J]. Vox Sang,2002,83(1):1-12.
[5] 夏 兰,蔡兴权,陈鑫萍,等 . 海南岛黎族人血小板 1-17 抗原系统基因多态性研究[J]. 中华医学遗传学杂志,2010,27(2):229-230.
[6] 邓燕玲,覃小梅,黄军垣 . 人血小板抗原基因多态性在广西壮族、瑶族、苗族、侗族及仫姥族老年人中的表达差异[J]. 中国老年学杂志,2012,32(6):2499-2501.
[7] 朱祥明,杨通汉,姚富柱,等 . 云南汉族血小板献血者 HLA-A、B 和 HPA 基因多态性的研究[J]. 临床输血与检验,2012,14(3):193-200.
