高原肺水肿相关9个SNPs多态性位点检测分析

　　目前,高原肺水肿( High - altitude pulmonary e-dema,HAPE ) 发病机制仍然不清楚,学者们提出HAPE 是遗传和环境因素共同作用的结果,具有遗传易感性。世界各个研究小组分别对肾素 - 血管紧张素 - 转换酶系统相关基因、内皮型一氧化氮合酶基因、酪氨酸羟化酶基因、血管内皮生长因子基因、肺泡表面活性蛋白基因、β2- 肾上腺素能受体基因、热休克蛋白 70 家族基因的众多多态性位点与HAPE 的易感性进行了相关性研究,但与 HAPE 发病密切相关的基因以及多态性位点报道不一。

　　前期,课题组利用 Affymetrix SNP Array 6. 0 芯片,对2010 年 5 月至 2012 年 7 月在青海省玉树地区执行援建任务时来自平原地区的 40 例 HAPE 患者和 33例健康对照者进行全基因组 SNP 分型,通过 PLINK软件对芯片结果进行全基因组关联分析( genome -wide association study,GWAS) ,筛选出在病例组与对照组间有显著差异的 SNP 位点,功能学分析表明这些位点附近的基因与 HAPE 的发生机制相关。

　　本研究选取9 个 SNPs 位点,采用改良多重高温连接酶反应( improved multiple ligase detection reaction,iMLDR) 方法检测这些多态性位点,并分析与 HAPE的相关关系。

　　1、 材料与方法

　　1. 1 研究对象

　　采用中华医学会公布的 HAPE 诊断标准,收集 2010 年 5 月 ~2013 年 7 月在青海省玉树地区执行援建任务时的 HAPE 患者 135 例,患者均在玉树州人民医院进行抢救和恢复治疗。HAPE 患者均为无亲缘关系的平原汉族居民,平时体健,无心血管及呼吸系统等其他器官疾病,且发病前从未来过高原。

　　对照组选择居住区域海拔、年龄、性别、劳动强度等与 HAPE 组相匹配的汉族健康对照者 137 例。采用调查表收集研究对象的一般情况,包括既往史、家族史、生活方式等,入选者知情同意后签字。分别抽取研究对象静脉血各 5 mL,EDTA 钠抗凝,室温放置15 min,离心( 2000r / min) 10 min,吸取上层血浆,置液氮保存备用,有核细胞层经红细胞裂解液处理后,加入 cell lysis buffer( Gentra Puregene Blood Kit) 室温保存。该项研究获得青海大学医学院伦理委员会审核批准。

　　1. 2 仪器与材料

　　DU800 核酸检测仪、5415D 高速离心机( Eppen-dorf 公司) ,DYY - 6B 型稳压稳流电泳仪( 北京六一仪器厂) ,UVP 凝胶成像系统( UVP 公司) 。GentraPuregene Blood Kit 血液基因组提取试剂盒( Qiagen公司) 。其他为国产分析纯试剂。

　　1. 3 候选位点

　　前期 Affymetrix SNP6. 0 芯片结果提示 HAPE 与转录调控和信号转导、调节免疫和炎症、参与脂质代谢及维持胞内葡萄糖平衡、钾通道、钙转运、细胞连接等诸多基因相关[4]。基于此,筛选 9 个 SNP 位点( 表 1) ,进行关联分析。

　　1. 4 实验方法

　　1. 4. 1 基因组 DNA 提取: 采用 Gentra PuregeneBlood Kit 基因组提取试剂盒,提取样本外周血白细胞基因组 DNA。DNA 样本经 1% 琼脂糖凝胶电泳对其进行完整度检查,核酸检测仪测定浓度,并将样本 DNA 稀释到工作浓度( 5 ~10ng/μL) 。

　　1. 4. 2 基因分型: SNP 位点的检测使用 iMLDR 法,所需 PCR 扩增引物( 表 2) 和多重单碱基延伸反应延伸引物( 表 3) 均由上海天昊生物科技有限公司设计,在上海生工生物科技有限公司合成,按要求稀释到指定浓度。分型实验委托上海天昊生物科技有限公司进行。反应体系( 10μL) 包含 1 × GC - I buffer,3. 0 mM Mg2 +,0. 3 mM dNTP,1 U HotStar Taq poly-merase,1 μL 样 本 DNA 和 1 μL 多重 PCR 引物。

　　PCR 循环程序: 95 ℃ 2 min; 11 cycles ( 94℃ 20s,65℃ - 0. 5℃ / cycle 40s,72℃ 90s) ; 24 cycles( 94℃20s,59℃ 30s,72℃ 90s) ; 72 ℃ 2 min; 4 ℃ 60 min;在 PCR 产物中加入试剂盒中的 ExoI/SAP 酶 1 μL,37 ℃ 温浴 1 h,然后 75 ℃ 灭活 15 min; 取试剂盒中的 10 × 连接缓冲液 2 μL、高温连接酶 0. 2 μL、连接引物混合液 1 μL 与纯化后多重 PCR 产物 3 μL、ddH2O 3. 8 μL 混匀。连接程序: 38 cycles ( 94℃1min,56℃ 4min) ; 4℃ 60min; 取 0. 5 μL 稀释后的连接产物,与0. 5 μL Liz500 SIZE STANDARD、9 μL Hi- Di 混匀,95 ℃ 变性 5 min 后上 ABI3130XL 测序仪; 收集的原始数据用 GeneMapper 4. 1( AppliedBio-systems,USA) 分析并输出结果。

　　【表2、3略】

　　1. 5 统计学处理方法

　　运用 Hardy - Weinberg 平衡规律检测样本代表性,医学统计软件 SPSS 17. 0 处理基因型和等位基因频率结果。计数资料各百分率比较用卡方检验,检验显著性水平,P <0. 05。

　　2、 结果

　　2. 1 候选 SNPs 分型结果

　　本实验采用 iMLDR 多重 SNP 分型试剂盒对272 个样本的 9 个 SNP 进行分型( 图 1) 。

　　2. 2 候选 SNPs 基因型与等位基因频率

　　经统计发现所有 SNP 位点均符合 Hardy -Weinberg 检验平衡定律。rs10932688、rs12655827、rs2017869、 rs4572038、 rs4984295、 rs11581271、rs17052028、rs3009568 的基因型和等位基因频率在HAPE 组和对照组之间差异 均 无统计学意义。

　　rs4906864 的基因型 TT 在 HAPE 组( 14. 8% ) 和对照组( 0. 08%) 组间差异有显著性( P < 0. 05) ,oddsratio 为 0. 425( 0. 187 ~ 0. 966) ; 等位基因 T 在 HAPE组( 38. 5%) 和对照组( 29. 9%) 组间差异有显著性( P < 0. 05) ,odds ratio 为 0. 682( 0. 477 ~ 0. 973)( 表 4) 。

　　【表4略】

　　3、 讨论

　　我们前期的研究结果提示,HAPE 与转录调控和信号转导、调节免疫和炎症、参与脂质代谢及维持胞内葡萄糖平衡、钾通道、钙转运、细胞连接等诸多基因相关。本研究针对前期工作筛选出的 9 个 SNP位点 与 HAPE 的相关关系进行研究,仅发现rs4906864 的基因型 TT 和等位基因 T 在组间差异有显著性。rs4906864 位于编码 γ - 氨基丁酸 A 受体β3亚基的基因 GABRB3 下游,γ - 氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸,γ - 氨基丁酸 A 受体是一个氯离子通道,能够通过离子通道的开闭,调节血压和中枢神经系统功能,可能与 HAPE 病理生理过程相关。对于前期工作筛选出的基因和SNPs 位点与 HAPE 间的相关关系仍需要进一步研究。