1例假性软骨发育不全患者的基因变异研究

　　假性软骨发育不全(PSACH)是一种以骨骼发育异常、身材矮小为特征的遗传性骨骼疾病,以常染色体显性遗传方式进行,外显率100%。PSACH患者中80%以上均属散发病例,由基因突变产生;不到10%患者则由家系遗传所引起。据文献统计,该病全球发病率为1/1.5万~1/2万,在中国的发病率更低,且对该病的研究与报道非常少见。软骨寡聚基质蛋白(COMP)基因是目前唯一报道的与PSACH发生有关的致病基因。在中国,PSACH患者很少,相关研究人员对此病了解较少,因而很少有文献对PSACH患者COMP基因突变进行研究、分析与报道。本研究通过基因测序方法对1例PSACH患者及其父母COMP基因进行突变分析。

　　1、资料与方法

　　1.1研究对象　本实验以1例初步诊断为PSACH患者及其父母为研究对象,共3人。患者女,年龄5岁,身高约107cm,临床表现为四肢短小、头大、前额突出、塌鼻梁,肘关节不能伸直且关节疼痛,脊椎发生侧弯,并且走路时出现典型的鸭步。患者父母均为正常人,没有发病症状。上述参与实验人员均获得并签署了知情同意书,自愿提供自己的DNA为研究样本。

　　1.2研究方法　外周血DNA提取:分别抽取上述患者及其父母外周静脉血2~3ml(EDTA抗凝混匀),采用美国Omega生物技术公司DNA提取试剂盒(BloodDNAMidiKit)从血液中提取DNA,用紫外分光光度计对DNA进行检测,A260/A280约为1.84。

　　引物序列设计:本实验所使用的引物是文献报道中针对外显子8-19序列聚合酶链式反应(PCR)扩增所需要的引物。引物序列及退火温度如表1所示。PCR扩增:采用日本Takara公司PCR扩增试剂盒(PCR　Amp　lification　Kit)。每个反应的总体积为25μl,反应体系内包括DNA模板50~200ng、上游引物与下游引物各1μmol/L、dNTP各200μmol/L、MgCl21.5mmol/L,10×PCR缓冲液2.5μl、TaqDNA聚合酶1U,其余用水补齐。采用PTC-200常规PCR扩增仪,PCR操作如下:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环35个周期,最后72℃延伸10min。PCR操作结束后电泳跑胶,观察PCR扩增结果。电泳结果如图1所示。

　　PCR扩增产物纯化及其测序:采用德国Qiagen公司QIAquickPCRPurificationKit试剂盒,将扩增好的PCR产物用纯化试剂盒进行纯化,去除产物中非特异性扩增产物及其引物二聚体等杂质。将纯化好的产物送测序部,使用美国ABI公司的3730XL测序仪对纯化产物进行测序。

　　2、结果

　　对1例PSACH患者及其父母COMP基因8-19号外显子进行测序筛查发现,患者第9号外显子上出现异常(杂合套锋),经分析为c.925G>A,该碱基突变导致第309位氨基酸由甘氨酸(Gly)转变为精氨酸(Arg),而在其父母相同位点处并没有发现碱基突变。进一步研究分析发现,该突变c.925G>A在国内相关文献中未见报道,国外相关文献中也少有对该位点突变的报道。图2为突变位点的基因测序峰图。

　　3、讨论

　　3.1COMP基因与PSACH相关性

　　PSACH是一种以骨骼发育异常为特征的骨骼疾病,主要由基因突变引起,目前世界公认的致病基因是COMP。1993年,Briggs等、Hecht等分别报道将COMP基因定位于19号染色体上。该基因为26Kb,相对分子质量为550000,由19个外显子和18个内含子组成,包括8个类钙调蛋白T3重复区(CLR),4个Ⅱ型类表皮细胞生长因子T2重复区(EGFR),1个螺旋区和1个羧基末端球状区(CTD)。在这些区域中,CLR是与PSACH关系最密切区域。据目前相关文献报道,超过80%致病突变碱基均在该区域中发现,且还有可能存在未发现的突变碱基;该区域还具有较强的Ca2+结合能力,如果在该区域内发生碱基突变,可能会导致基质蛋白不能很好地与Ca2+结合,阻碍软骨细胞分化。

　　COMP主要分布在软骨细胞的细胞外基质中,当其功能发生改变后,可影响蛋白之间的相互作用,减弱蛋白上的电荷极性,从而引起蛋白迅速沉降或分解,导致软骨细胞分化终止或凋亡,延缓骨骼线性生长。Dinser等经牛软骨细胞内COMP突变研究发现,COMP基因突变导致软骨细胞分泌延迟,同时在细胞外基质中形成一定数量的非晶体聚合物,可显著较低软骨细胞存活能力,继而发生软骨细胞凋亡。

　　Posey等经基因操作法检测COMP碱基突变小鼠体内软骨细胞表达,结果发现体内软骨细胞凋亡速度明显增加,且细胞外基质蛋白在基质内明显滞留。还有一些研究发现,COMP有可能在基质组装中发挥着重要作用,当COMP发生碱基突变,软骨细胞基质中离子通路发生改变,引起基质中部分蛋白含量急剧减少,间接导致PSACH产生。

　　与PSACH相关的致病突变碱基,目前报道有90多个。超过97%突变位点均定位于8-19号外显子所编码区域。本实验针对8-19号外显子序列设计引物及其PCR扩增,经测序筛查后发现该患者第9号外显子发生了碱基突变(c.925G>A),导致第309位甘氨酸(Gly)转变为精氨酸(Arg)。该碱基突变尚未在国内人群中发现,国外也仅有少量文献报道。

　　Kennedy等于2005年报道1例PSACH患者,在其COMP基因第9号外显子上发现c.925G>A,结果导致p.Gly309Arg。Nakayama等于2003年报道1例日本PSACH患者,在其COMP基因第9号外显子上发现c.925G>C,同样导致p.Gly309Arg。研究分析提示,此碱基突变位点不在保守序列区内,因而有可能碱基替换后阻碍了COMP转录精确性,引起编码蛋白质C末端发生变化,导致PSACH产生。目前国内外对该突变位点的报道较少,尚需进一步研究分析该位点碱基突变与PSACH相关性。

　　3.2国内诊断PSACH方法

　　国内对PSACH的诊断与研究还处于较低水平,临床医生大多根据疑似患者的临床表现及放射学特征诊断PSACH。这种诊断方法存在一定的误诊或漏诊风险,主要原因在于:PSACH临床症状与软骨发育不全或干骺端发育不良十分相似,均属骨骼发育障碍引起的身材矮小,因而给诊断带来困难;PSACH发病较晚,一般在3岁以后才会出现典型症状,既不利于疾病预防与治疗,又可能造成早期患儿的误诊或漏诊。据不完全统计,国内2010年前总共发现24例PSACH患者,均是依据患者临床表现及放射学特征。然而国内人口基数很大,PSACH患者人数远不止24例,因而可能有更多PSACH患者被漏诊或误诊。基因测序是目前国内外检测PSACH的金标准,通过筛查COMP基因突变,找到突变位点来确诊PSACH。随着PSACH研究逐步深入,2010年后基因测序越来越多地应用于突变碱基筛查,PSACH患者确诊率因而得到提升。基因测序方法还可应用于产前诊断。

　　PSACH属于单基因突变遗传性疾病,无法进行有效治疗,如果在产前能诊断出胎儿基因突变并确诊,既可有效预防PSACH患者出生,保证胎儿健康状况,又可减轻胎儿家庭压力与负担。因此,基因诊断必将成为一种重要诊断方法得到临床广泛推广与应用,尤其在胎儿产前诊断与罕少见遗传病诊断方面。