液基细胞学检查的广泛应用明显降低了宫颈癌的发病率，但其筛查敏感度较低，易出现假阴性结果［1］。HPV 感染是宫颈癌发病的首要因素，HPVDNA 检测也成为宫颈癌筛查的一种重要手段，但由于大多数 HPV 感染具有自限性，很少进展成高级别病变，因此 HPV 检测在宫颈癌筛查中特异度也偏低，易出现假阳性结果［2］。且上述筛查手段( 包括联合筛查) 仅把可能的宫颈病变找出来，对早期病变的进展及转归无法准确判断，故筛查结果并不是十分可靠的恶变潜能指标。因此，临床上迫切需要一种新的方法和指标以早期发现尚处于低度病变的高危患者。近年来研究发现，人端粒酶 ＲNA 基因( human telomerase ＲNA component gene，hTEＲC) 的异常表达是肿瘤发生的基础，hTEＲC 基因的异常扩增也可能是宫颈癌形成的早期事件［3，4］。本文通过FISH 技术分析了 hTEＲC 基因在宫颈上皮癌变过程中的表达，评估 hTEＲC 基因检测的临床价值，为宫颈 CIN 的早发现、早诊断提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 收集并筛选 2011-05—2013-05 间在本院专科就诊的 115 例宫颈活检组织标本，参照《病理学》诊断标准［5］，分为正常组( 包括炎症者) 25例，CINⅠ27 例，CINⅡ26 例，CINⅢ 18 例，宫颈癌( 鳞癌) 19 例; 患者年龄 18 ～ 64 岁，平均 37. 3 岁。所有标本均由 2 名高年资病理医师统一确定诊断。FISH 所用 GSP TEＲC / CSP3 探针由广州安必平医药科技有限公司提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 组织制片 所有活检标本经 4% 中性甲醛固定 6 ～24 h，全自动组织脱水机处理，常规石蜡包埋，4 μm 厚切片，65 ℃下烤片过夜备用。
1. 2. 2 检测前预处理 65 ℃ 烤片 5 min，室温下二甲苯 20 min × 2; 100% 乙醇 5 min × 1; 依次 100%、85% 、70% 乙醇各 1 次 × 3 min，去离子水 3 min。100 ℃ 的沸水 20 min，晾干。37℃ 蛋白酶 K 工作液消化 8 ～ 20 min，镜下观察，消化适宜后，2 × SSC 溶液中漂洗 5 min ×2。依次 70%、85%、100% 乙醇脱水，各 3min，室温晾干。
1. 2. 3 FISH 检测 ①避光滴加 10 μl 杂交液( 含探针) ，荧光原位杂交仪上变性及过夜杂交( 变性温度83 ± 1 ℃ ，5 min; 杂交温度 42 ℃ ) 。②次日移去盖玻片，放入 46 ±1 ℃的2 × SSC 溶液5 min ×2。70%乙醇 3 min，暗处自然干燥。滴加 10 μl DAPI 复染剂，暗处 －20℃放置 20 min 后，荧光显微镜下观察。
1. 3 结果判定 ①信号判定: GSP TEＲC 探针的荧光信号为红色，CSP3 对照探针信号为绿色。正常细胞间期胞核中红、绿信号各 2 个，若单个胞核中红色信号 ＞2 个，绿色信号≥2 个，则该细胞为 TEＲC 基因扩增异常细胞。②阈值建立: 参照文献［6］报道，取20 例正常宫颈标本，以上述方法行 FISH 实验，每例分析 100 个细胞，统计出现 TEＲC 基因扩增异常细胞数目的百分比。异常阈值 = 平均数 + 3 × 标准差。本研究 TEＲC 阈值 =7. 13%，故设≥8% 为异常阈值，判断 TEＲC 基因扩增结果阳性。③结果判读:每例样本随机计数 100 个细胞，若异常细胞数的百分比 ＞ 阈值，为( + ) ; 若 ＜ 阈值，为( － ) ; 若等于阈值，则加大观测细胞数。
1. 4 统计学分析 采用 SPSS13. 0 统计学软件分别进行 χ2检验、Fisher 确切概率法、Spearman 等级相关分析及方差分析，绘制 ＲOC 曲线，计算 ＲOC 曲线下面积; 以病理为最终诊断计算 hTEＲC 基因检测对识别高级别宫颈病变( ≥CINⅡ) 的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值和诊断比值比。
2 结果
2. 1 hTEＲC 扩增率 115 例宫颈活检组织标本中，hTEＲC 基因在正常组、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞状细胞癌组中的扩增率分别为 4%、22. 2%、73. 1% 、83. 3% 和 94. 8% ，hTEＲC 基因的扩增率随着病变程度的加重而增高，各组间差异显着( P ＜0. 01) ，尤其当宫颈病变由低级别( ≤CINⅠ) 转变为高级别甚或癌时( ≥CINⅡ) ，hTEＲC 基因的扩增率显着升高( χ2= 13. 75，P ＜ 0. 01) 。同时，hTEＲC 基因的扩增率与病变的恶性程度呈正相关( r =0. 696，P ＜ 0. 01) ( 表 1) 。
2. 2 hTEＲC 基因阳性扩增的异常细胞数 hTEＲC基因扩增的异常细胞数在宫颈低级别病变( 正常和CINⅠ) 时就可出现，但均处于较低水平，差异不显着( P ＞0. 05) ; 而当病变由低级别转变为高级别( ≥CINⅡ) 时，异常细胞数则显着提高( F = 25. 42，P ＜0. 01) ，且稳定在较高水平( CINⅡ ～ 癌组间无差异，P ＞ 0. 05) 。hTEＲC 基因扩增的异常细胞数与宫颈病变的恶性程度呈明显正相关 ( r = 0. 721，P ＜0. 01) ，同时，随着宫颈病变的加重，hTEＲC 基因多重比例扩增率( 红∶ 绿之比为4∶ 2、5∶ 2、4∶ 4、6∶ 5者)具有升高趋势( 表 1，图 1 ～4) 。
2. 3 hTEＲC 基因检测对预测宫颈高级别病变的临床评价 在宫颈高、低级别病变各组中，hTEＲC 基因扩增率及异常细胞数无差异( P ＞ 0. 05) ，故将其各自合并成 2 组 ( 表 2) 。63 例高级别病变中hTEＲC 基因扩增 52 例，阳性率 82. 5% ; 52 例低级别病变中 hTEＲC 基因扩增 7 例，阳性率 13. 5%; 两者差异显着( P ＜0. 01) 。hTEＲC 基因检测宫颈高级别病变的敏感度为 82. 5%，特异度为 86. 5%，阳性预测值 88. 1%，阴 性 预 测 值 80. 4%，诊 断 准 确 度84. 4% ，阳性似然比 6. 1，阴性似然比 0. 2，诊断比值比 30. 5; 其 ＲOC 曲线下面积达 0. 862( 图 5) 。
3 讨论
宫颈癌的有效筛查和早期诊断是降低其发生率和病死率的关键。高危型 HPV 感染和整合是公认的宫颈细胞癌变的致病因素，但需要宿主遗传因素的参与才能导致细胞的恶性转化［6］。研究表明，宫颈上皮细胞瘤变过程中几乎均伴有 3 号染色体长臂的扩增，其中最重要的就是编码人端粒酶主体结构的端粒酶 mＲNA 基因( hTEＲC) 。hTEＲC 基因的表达上调可激活端粒酶活性而维持端粒长度，引起染色体异常，使细胞逃避凋亡，导致宫颈癌发生。
hTEＲC 基因的扩增可出现在宫颈病变早期，且扩增率与宫颈病变程度显着相关。Heselmeyer-Haddad 等［7］最早采用 FISH 方法研究宫颈细胞涂片中 hTEＲC 基因的表达情况，发现正常、ASC、LSIL 标本中只有少数病例 hTEＲC 基因扩增，而在 CINⅡ、Ⅲ组中 hTEＲC 基因的扩增比例分别达 63% 和76% ，且四倍体细胞数和 hTEＲC 基因扩增率随宫颈病变的严重程度而增加。Andersson 等［8］研究也发现，hTEＲC 基因扩增率在正常组和 CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ分别为 7%、24%、64% 和 91%，在宫颈癌组达 100%，hTEＲC 基因的阳性率随着病变的加重而增高，尤其是在 CINⅠ和Ⅱ之间更加明显。进一步的随访研究还发现［3］，有 hTEＲC 基因扩增的低级别上皮内瘤病病例 1 ～3 年进展为高级别者达 40. 7%，而自愈者则无1 例存在 hTEＲC 基因扩增; 并且33%细胞学正常而 hTEＲC 基因扩增者，在经过短暂的潜伏期后可进展为高级别病变; hTEＲC 基因扩增者恶性转化率达 52% ～ 96%，hTEＲC 基因扩增对于判断 CINⅠ/Ⅱ向 CINⅢ进展的敏感性达到 100% ，特异性为70% 。由此可见，hTEＲC 基因同时也是一个可靠的预测宫颈病变进展的生物学因子。
本研究中，hTEＲC 基因在正常宫颈组织和 CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及宫颈鳞状细胞癌中的阳性扩增率分别为4% 、22. 2% 、73. 1% 、83. 3% 和 94. 8% ，随病变严重程度增加 hTEＲC 基因扩增率也增加，两者具有较明显的正相关关系，与上述研究结果一致; 并 且hTEＲC 基因的扩增在宫颈病变的早期尤其是 CINⅠ中就可出现，且这种基因的改变伴随着从 CINⅠ至CINⅢ及宫颈鳞状细胞癌的全过程。可见，hTEＲC基因扩增与 CIN 的严重程度有关，可能是宫颈癌形成的早期事件。值得注意的是，在本研究中，当病变由低级别病变( ≤CINⅠ) 进展为高级别时( ≥CINⅡ) ，hTEＲC 基因扩增率由 22. 2% 增高到 73. 1% ，异常细胞数也由 5. 8 ± 6. 2 增高到 25. 9 ± 18. 2，变化显着，提示 hTEＲC 基因的异常扩增在宫颈 CINⅠ向 CINⅡ进展过程中扮演着重要角色，可能与宫颈病变不可逆转的恶性转化密切相关，而这一特点有助于临床预测 CINⅠ/Ⅱ的进展或转归，也可辅助常规病理对 CINⅠ和 CINⅡ的诊断与分级。本研究还显示，随着宫颈病变的加重，hTEＲC 基因多重比例扩增率有升高趋势，即 hTEＲC 基因和 3 号染色体同时发生了非整倍体扩增，提示细胞恶性度增加。这与文献报道一致［9，10］。因此，通过检测 hTEＲC 基因扩增情况并分析 hTEＲC 基因扩增类型，有助于评估宫颈病变的严重程度，预测宫颈病变的恶性转化潜能［1，8］。
hTEＲC 基因作为诊断宫颈病变的生物遗传学指标，其鉴别宫颈低级别病变( ≤CINⅠ) 和高级别病变( ≥ CINⅡ) 的敏感度和特异度一般在 63. 9%～ 90% 和 81. 9% ～ 93. 3%［10 －12］。最近的一项 Meta分析［13］显示，hTEＲC 基因诊断高级别病变的合并敏感度、特异度和诊断优势比分别为 0. 81、0. 83 和17. 4，其 ＲOC 曲线下面积为 0. 891; 与常规筛查方法相比［2］，其敏感度高于液基细胞学检查( 53. 9%) ，而低于 HPV 检测( 91. 3%) ; 其特异度高于 HPV 检测( 39. 3%) ，但比液基细胞学检查低( 93. 3%) ; 其诊断准确度及 ＲOC 曲线下面积略高于其他两者; 说明 hTEＲC 基因单独用于筛查宫颈高级别病变有较高的诊断价值，但其筛查效率的优势并不明显。本研究中，采用石蜡标本进行 hTEＲC 基因 FISH 检测，结果显示，hTEＲC 基因扩增对识别宫颈高级别病变的敏感度和特异度分别为 82. 5%和 86. 5%，诊断准确度为 84. 4%，诊断优势比 30. 5，ＲOC 曲线下面积达 0. 862，与上述的研究结果基本一致。但 hTEＲC基因扩增对宫颈高级别病变的阳性预测值达到88. 1% ，说明 hTEＲC 基因扩增的病例宫颈发生恶性转化率较高，这与 Heselmeyer-Haddad 等［3］在宫颈细胞学水平的研究结果相同。
hTEＲC 基因既是一个与宫颈病变程度密切相关的遗传标记物，又是一个较为可靠的预测恶变潜能的分子标记物，可作为宫颈病变早期筛查、检测病情、评估预后的辅助指标。但单独使用时识别宫颈高级别病变未能表现明显的优越性，加上其检测成本昂贵，需要特殊设备和专业人员，尚不适合在宫颈癌普查中广泛运用。由于石蜡标本 hTEＲC 基因FISH 检测稳定可靠，对≥CINⅡ病变的诊断敏感度和特异度等指标均 ＞ 80%，对常规病理鉴别 CINⅠ与 CINⅡ有困难时或由于人为因素影响 CIN 级别判断时，可起重要的辅助作用，可明确组织分级、减少漏诊误诊、避免临床治疗不足或过度治疗。同时，由于 hTEＲC 基因具有预测恶变风险作用，有助于及早发现尚处于低度病变的高危患者，有利于临床及时采取干预措施，减少宫颈高级别病变的发生; 对临床常见的复发性低级别 CIN，hTEＲC 基因检测可为判断宫颈病变的进展或转归提供一种有力的依据。
在常规的临床实践中，选择性地联合使用hTEＲC 基因检测及细胞学检查和 HPV 检测这两项传统的宫颈癌筛查技术，将有助于提高对宫颈癌前病变的检出率，降低宫颈癌的发病率和死亡率。
参考文献:
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