肺炎支原体 ( myeoplasma pneumoniae,MP) 是一类没有细胞壁,呈高度多形态性,可通过细菌滤器,能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物.由于这类微生物无细胞壁,常呈丝状或分支状,故称其为支原体[1].肺炎支原体是引起急性呼吸道感染的常见病原体之一,主要由口、鼻分泌物经空气传播,是引起人类支原体肺炎 ( 亦称为原发性非典型性肺炎) 的病原体,近年来 MP 感染率呈逐年上升趋势[2],尤其多见于儿童,可占小儿肺炎的 10%~ 20% ,流行年份可达 30%[3,4].支原体感染一年四季均可发生,但以 8 ~10 月份发病率最高.支原体肺炎肺部体征较轻,甚至无症状,根据流行病史、患者的临床症状、胸片等检查常常不容易将其与一般病毒、细菌及结核杆菌感染引起的呼吸道感染相区别[5].由于其与人体某些组织存在着部分共同抗原,故感染后可形成相应的自身抗体,引起血液系统、神经系统、消化系统、心血管系统以及肌肉、皮肤、关节等器官的免疫损害,病情严重者还可危及生命.
随着人们对肺炎支原体认识的不断加深和检测技术的迅速发展,实验室诊断方法也日益增多.目前针对MP 的实验室诊断技术主要有病原体的分离与培养法、免疫学检测、分子生物学检测等几类,本文通过查阅检索大量文献资料将检测 MP 的方法进展综述如下.
1 肺炎支原体的分离与培养
培养法是检测病原体存在的直接证据,是检测肺炎支原体的金标准.可分为一般的固体培养法和快速培养法.
1. 1 固体培养法 肺炎支原体对培养基的营养要求较高,除基础营养物质外,培养基中需加入 10% ~20% 的人或动物血清,以提供胆固醇和长链脂肪酸,并可稳定细胞膜.初次分离培养时需添加 10% 的酵母浸膏,并提供 5%CO2,最适 pH 值为 7. 6 ~8. 0,低于 7. 0 时将导致其死亡.最适温度为 36 ~ 37 ℃,支原体生长缓慢,在 1. 4% 血琼脂培养基上培养 3 ~10 d 可形成 "油煎蛋样" 菌落.菌落在低倍镜下观察核心区较厚呈圆形,如同蛋黄伸入培养基中,周围薄薄一层颗粒区,形同蛋清,菌落同时能吸附豚鼠红细胞并能产生溶血素,出现溶血环.在实验室培养中出现即可确诊为肺炎支原体[6].
培养法是检测肺炎支原体的金标准,一旦检出,即可确诊.但其缺点在于需要的时间长,一般培养需2 周左右,生长条件苛刻,当标本中 MP 数量少、培养基营养标准不够或操作方法不当时,就会出现假阴性结果; 并且呼吸道存在较多的杂菌,阳性率低,直接影响临床的快速诊断,使患者得不到及时有效的治疗.目前仅在科研单位进行科研活动,临床一般不采用.
1. 2 快速液体培养法 近年来,随着微生物诊断技术的快速发展,已经出现 48 ~ 72 h,甚至 24 ~ 48 h即可出结果的肺炎支原体培养试剂盒,并可同时做药敏试验,这在一定程度上弥补了传统培养时间慢的缺点.咽部分泌物、支气管分泌物、痰液等都可作为标本进行 MP 的培养,该方法对实验室的要求不高,可明显缩短 MP 培养法的检测时间,并且避免了抽血造成的痛苦,尤其适用于年龄较小的儿童.
该方法的原理是肺炎支原体在生长过程中发酵葡萄糖产酸,使培养基中酸碱指示剂发生颜色变化来作为肺炎支原体生长的指征,并且在培养的同时进行药敏试验,可大大缩短检测的时间.标本中其他支原体和细菌则因培养基中加人了青霉素、醋酸陀和生物抑菌剂而被抑制[7]从而保证该方法的特异性[8],但当样本中有分解葡萄糖的非目的菌对培养基中的抑菌剂无效时可能造成假阳性结果[9],影响到诊断的准确性[10].如果患者检测前已经服用对 MP 敏感的药物会导致检出率降低.据谢国艳等[11]报道,这种方法检测 MP 的假阳性率较高,细菌和真菌的培养阳性率已达到了 7. 9%,因此有必要在培养 48 h 作第一次判定结果后转种进一步做一般细菌培养,再一次对培养结果作分析后才能做出准确判断.同时,从试验结果看出,引起 MP 培养假阳性的标本中真菌所占比例最大 ( 主要为念珠菌) ,已达到 71. 1%,说明真菌感染时 MP 的培养阳性率会大幅度提高,这可能与念珠菌在呼吸道疾病中多见而 MP 培养又多取材于呼吸道有关,故此项检测方法有一定的局限性.
另外在观察药敏结果时,致病病原体所致的假阳性可在一定程度上反映该病原体对抗生素的敏感程度,药敏结果可提供一定的临床价值,但是非致病菌所致的假阳性就有可能误导临床用药治疗.
2 肺炎支原体的免疫学检测
2. 1 肺炎支原体抗原检测
2. 1. 1 采用不同株 MP 单抗,用双抗体夹心 ELISA法检测 MP 抗原,该方法技术操作较简单,特异性也强,与种属相近的支原体没有交叉反应,用 PCR 方法做平行测得,结果显示无显着性差异[12].
2. 1. 2 采用荧光素标记的 P1 蛋白单克隆抗体检测痰或咽拭子标本中的 P1 蛋白抗原.此法特异性强,但单克隆抗体制备复杂、技术要求高,还未普遍开展.
2. 2 肺炎支原体抗体检测
2. 2. 1 非特异性抗体试验
2. 2. 1. 1 冷凝集试验 ( Cold agglutination test,CAT)一种诊断肺炎支原体感染的非特异性试验.冷凝集素是抗红细胞 I 抗原的 IgM 抗体,在 0 ~4℃条件下可凝集患者的 O 型红细胞或自身红细胞,在 37℃ 时呈可逆性的散开.多数肺炎支原体患者于感染后第 2 周血中冷凝集素效价达到 1∶ 32 或更高,一般以效价达1∶ 64 或动态检测增长 4 倍以上时有诊断意义.抗体滴度和特异性随肺炎严重程度增加.但本试验特异性不强,除肺炎支原体患者外,如传染性单核细胞增多症,肝病,溶血性贫血,流行性感冒,风疹,婴幼儿腺病毒、副流感病毒等引起的肺炎和呼吸道感染等病毒性疾病的患者,血中都可检测到冷凝集素,出现假阳性反应.因此,临床诊断价值不大,但因其方法简单,在长时间内作为辅助诊断肺炎支原体的方法,随着检测技术的不断发展,现在已基本被淘汰.
2. 2. 1. 2 MG 链球菌凝集试验 肺炎支原体感染后,约有 1/3 的患者血清中可出现能和甲型链球菌 MG 株凝集的抗体,效价≥1∶ 20,而病毒性肺炎不出现此抗体,有助于两者的区别.
2. 2. 2 特异性抗体试验 肺炎支原体感染后可产生特异性的 IgM、IgG 类抗体.其中 IgM 类抗体出现最早,检测 MP - IgM 可作为早期感染的诊断指标,但重症感染及再感染者可能无此抗体产生.因此 MP -IgM 阴性不能否定 MP 感染,需检测 MP - IgG 和 IgA抗体,但特异性不如 IgM.
2. 2. 2. 1 补体结合试验 ( Complement fixation test,CFT) 人感染 MP 后,MP 的抗原糖脂成分刺激机体产生特异性抗体,与肺炎支原体细胞膜成分致敏的绵羊红细胞结合形成固着补体使之不发生溶血反应,反之则激活补体,与后加入指示系发生溶血反应.抗体滴度在 1: 32 以上有诊断价值.补体结合试验的敏感性高,特异性很好,缺陷是初次感染时出现阳性率高,再次感染时容易出现假阴性反应.并且与生殖道支原体及嗜肺军团菌存在交叉反应,在某些神经系统疾病和急性胰腺炎时可出现假阳性,且补体结合试验操作较繁琐,不适用于临床常规检测.因此这种方法目前临应上不常用.
2. 2. 2. 2 被动凝集试验 是目前广泛应用于临床的诊断肺炎支原体感染的一种方法,大多使用由日本富士瑞必欧株式会社生产的 SERODIA@ 一 MYCOⅡ试剂盒.其采用肺炎支原体 ( Mac 株) 细胞膜成分致敏人工明胶粒子,通过致敏粒子与人血清中的 MP 抗体发生凝集反应,操作简单,影响因素少,并尽可能消除以往被动凝集试验以动物红细胞为载体所引起的非特异性凝集,凝集图像清晰,过夜后再判读不发生显着变化,并且结果判断容易.具有操作简单、特异性强、设备要求低等优点,较适合临床使用,是一项值得推广的技术.不足之处是该技术的灵敏度仍然不够高,随着 MP 特异性抗原的不断发现,被动凝集法诊断技术将更加完善,检测灵敏度也必将提高.
2. 2. 2. 3 酶联免疫吸附试验 ( Engyme - linkedimmu-nosorbent assay,ELlSA) 酶免疫测定技术中应用最广的技术.ELISA 具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,应用于肺炎支原体,可检测 IgM 和 IgG 抗体,方法敏感,特异性高,是诊断肺炎支原体感染实用可靠的手段,现在已有多家厂商出售 ELISA 试剂盒,在临床上应用也很广泛.ELISA 法是国内应用较为成熟的实验方法,其有较高敏感度的优点为大家长期所接受,但其反应时间长,反应步骤也相对较多,检出率虽与 PCR 法检出率相当. 但也需要洗板机、酶标仪等设备,而且所需时间较长.
2. 2. 2. 4 间接免疫荧光试验 ( Immuno - fluorescencetest,IFT) 免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种.该方法是用 MP 在培养基上生长的菌落做抗原,检测 MP - IgM、IgG 抗体.该方法特异性高,但敏感性稍差,并且需要购置荧光显微镜才能观察.
2. 2. 2. 5 金标渗滤法 ( GIFA) 和金标免疫层析法( GICA) 二者都是一种以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的免疫标记技术,反应原理基本相同.两种检测方法均无需任何仪器设备,操作简单快捷,最适宜一般基层医院开展应用,但结果报告只能告之以阴性阳性,不能报告滴度.
2. 2. 3 MP 外膜蛋白抗体测定 通过研究证明 MP 的某些膜蛋白具有抗原性及免疫原性.P 蛋白是主要免疫原之一.Jocobs 用免疫印迹法分析 MP 患者血清,发现在感染急性期、恢复期及感染后 5 个月能测出 P蛋白抗体,认为 P 蛋白可用于 MP 感染的实验室诊断.
3 肺炎支原体的分子生物学检测
随着分子生物学的不断进展及实验诊断学的进步,分子生物学技术在支原体研究领域也被广泛地应用,发展了聚合酶链反应 ( PCR) 和基因探针等分子生物学检测方法[13 -14],对疾病的诊疗起了较大的推动作用.
3. 1 聚合酶链反应 ( PCR) 可分为普通 PCR、荧光定量 PCR、实时定量荧光 PCR.1992 年 PCR 法开始应用于 MP 感染的临床标本的检测,在 MP 感染早期诊断优于血清学试验和生物芯片法,被认为是诊断MP 感染的一种有价值的方法,但引物的选择是关键.
MP 含 DNA 和 RNA 两种核酸,其基因组为环状双链DNA.Jensen 根据 16rRNA 基因的可变区 P1 蛋白基因的序列设计出两对引物扩增上述两基因的一部分( 583 bp 和 153 bp) ,经实验证明此法快速、特异、敏感[11],可检出≥10 cFu/ml 的 MP.
PCR 法检测快速、特异性和敏感性高,检测标本中的 MP 不需要是活体,不受患者免疫功能、病程、感染程度、有无使用药物治疗及未达到血清检测水平的影响,可以更早期地检测到 MP 的感染,使 MP 的早期诊断和抗生素的正确选择成为可能.对早期及未生成抗体者及抗体已消失的感染患者有积极的意义;有助于早期诊断,及时治疗,并且不存在交叉反应和放射性污染,易标准化.
虽然 PCR 法检测快速,在某种意义上可替代培养法,但其高敏感性也使 PCR 法对实验环境和仪器要求比较高,存在着技术条件要求高、操作复杂、不易普及的问题,一般基层实验室难以开展,且价格也相对较高.实时定量荧光 PCR 将基因扩增的敏感性以及分子杂交的特异性以及光化学的精确性合二为一来对肺炎支原体进行检测,通过基因技术,可以在较短的时间内使含量极低的核酸片段扩展至数百万个拷贝,因此灵敏度、特异性均较高,且操作简单,是目前公认的准确性和重复性最好的核酸分子技术.
3. 2 基因探针 随着分子生物学的发展,DNA 探针杂交技术被用于 MP 的检测,提高了特异性和敏感性,但由于操作复杂,又需防放射性污染,因此限制了它的临床应用.
基因检测法的高敏感性、高特异性在能够对微量样本和早期感染样本进行检测的同时,也容易因为操作不当或环境因素而受到污染导致结果的不可靠,另外该法要求特殊的仪器、较高的人员素质,也是限制其使用的因素.
3. 3 蛋白芯片法 蛋白芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术,是一种高通量、高灵敏度、高特异性,且微型化的蛋白质分析技术.
蛋白芯片分析本质上就是利用蛋白质之间的相互作用对样本中存在的特定蛋白质进行检测,可同时快速发现多个生物标记物.但芯片法成本高,同时大量不同蛋白质的高效表达与纯化问题有待提高.蛋白芯片法检测肺炎支原体感染具有重复性好、操作简便、快速等优点[15],但是利用蛋白芯片技术对于蛋白质功能的研究仍然存在着种种问题.因此,蛋白质芯片法检测肺炎支原体感染的临床应用价值还需要进一步探索.
4 肺炎支原体的活体检测
利用超高倍显微镜直接检测肺炎支原体,该方法经济、简便、快速、直观,并配有彩图,最大限度地增加了患者的信任度[16 -17].病理研究证实肺炎支原体是呼吸道及其他器官感染的重要病因之一.支原体肺炎的治疗关键在于及时确诊并予以针对性治疗,能够在早期快速地对感染MP 的患者进行确诊,避免滥用抗生素,给患者提供及时有效的治疔,减轻患者的经济负担,所以建立有效、敏感的早期检测方法十分重要.
综上所述,随着科学技术的不断发展,检测肺炎支原体的方法日益增多,各有其优缺点.传统的分离培养方法要求高、敏感性低、耗时长等,限制了其在临床上的应用.免疫学检测,其特异性和敏感性适中,简便快捷,尤其是血清被动凝集试验和 ELISA这两种检测方法更为适合一般实验室常规检测.分子生物学检测法具有高敏感性和高特异性、检测快速,在某种意义上可替代培养,但其高敏感性也对实验环境和仪器要求高,其高假阳性制约了方法的广泛使用.这就要求在选择试验方法时,要根据各自实验室的技术条件和经济条件选择敏感性和特异性相对较高,又适合临床检测要求的检测方法,必要时结合患者的临床表现,可选用一种或多种方法联合检测.
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