阴道涂片法确定大鼠生理周期的准确性研究

　　SD大鼠为最常用的实验动物之一，雌性SD大鼠的生理周期为4～5d，根据雌性大鼠性欲表现及生殖器官变化分为动情间期，动情前期，动情期和动情后期 。动情前期持续时间17～21 h，动情期持续时间9～15h，动情后期持续时间10～14h，动情间期持续时间60～70h 。在大鼠生理周期的不同阶段，雌二醇表达水平也不同，在动情后期开始增长，动情前期达到峰值，动情期回到基础值 。在动物生殖或内分泌相关实验中 ，需要确定其生理周期。目前，对于雌性大鼠生理周期的判断，文献上使用较多的方法是阴道涂片法，通过对巴氏染色法与细胞计数方法 和亚甲蓝染色法 比较，认为阴道涂片方法基本可信。本实验通过比较大鼠血清中雌二醇含量和阴道涂片法确定阴道涂片法的准确性。对20只处于性成熟期的雌性大鼠进行阴道涂片观察，确定其生理周期，通过化学发光免疫分析法检测血液中雌二醇的含量，明确阴道涂片方法的可靠性。

　　1、材料与方法

　　1.1 动物分组、主要试剂与仪器

　　SD雌性大鼠20只，体重230-280g，均购自中国医科大学动物中心，普通饲料喂养，自由饮水，正常光照。将20只大鼠采用阴道涂片法根据阴道涂片细胞变化特点分为动情间期组（n=5）、动情前期组（n=4）、动情期组（n=6）和动情后期组（n=5）。

　　光学显微镜（OLYMPUS CK×41）、全自动化学发光免疫分析仪（ADVIA Centaur XP）、离心机（YINGTAI Td5）。

　　1.2 涂片方法，性周期各阶段的判定标准

　　按照参考文献 中大鼠性周期阴道涂片的细胞变化特点来划分大鼠性周期的各阶段：动情前期：涂片可见大量有核上皮细胞、少量角化上皮细胞；动情期：涂片可见满视野角化上皮细胞、少量有核上皮细胞；动情后期：涂片可见有核上皮细胞、角化上皮细胞及白细胞均可见；动情间期：涂片可见大量白细胞和少量黏液。

　　将大鼠水合氯醛腹腔内麻醉（250 mg/kg），固定于手术台上，用沾有生理盐水的小棉棒在阴道口处稍停留，轻轻插入大鼠阴道并且缓慢转动，慢慢将小棉棒取出，将小棉棒上沾有的粘液均匀涂在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察。

　　1.3 雌二醇含量检测

　　将阴道涂片后的大鼠进行腹主动脉取血，取出4～5ml血液静置5min，3000rpm，离心4min后经全自动化学发光免疫分析仪测定血清中雌二醇含量。统计学分析：全部数据均以 表示，所得数据经统计学处理分析，差异显著与否进行t检验，以<0.05为差异有显著性意义， <0.01为差异有非常显著性意义。

　　2、　结果

　　2.1 各阶段生理周期大鼠的阴道涂片动情间期的特点：显微镜下可观察到大量白细胞及少量有核上皮细胞粘液；动情前期阴道涂片特点：显微镜下可见大量椭圆形的有核上皮细胞，偶见少量角化细胞；动情期特点：显微镜下可见大量外形不规则的角化上皮细胞，间有少量有核上皮细胞；动情后期的特点：显微镜下不规则角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞均可见，且比例相当 。

　　2.2 各阶段生理周期大鼠血清中的雌二醇水平通过化学发光免疫分析测定各组雌二醇含量，动情间期组雌二醇含量为 65.04±19.86 pmol/L，动情前期组为 169.56±34.73 pmol/L，动情期组112.32±30.19 pmol/L，动情后期组为 60.09±9.12pmol/L。与动情间期组比较，动情前期组和动情期组血清中雌二醇含量明显升高，其中动情前期组差异有非常显著性意义（ <0.01），动情期组差异有显著性意义（ <0.05），动情后期组无明显差异（图2a）。根据实验数据可得，动情前期组雌二醇含量最小值为125pmol/L，动情间期组和动情后期组全部小于125pmol/L，动情期组仅有一点大于125pmol/L（图2b）。

　　3、　讨论

　　阴道壁由粘膜、肌层和外膜组成。粘膜向阴道腔内形成许多横行皱裂，由上皮和固有层构成。阴道上皮的脱落和新生与卵巢活动周期有密切关系，因而根据阴道脱落上皮细胞类型不同可推知卵巢的功能状态 。阴道涂片法是常用的大鼠生理周期判断方法，阴道涂片常见的三种细胞形态辨认较简单，体积较大的角化上皮细胞，外形不规则可见钝角；体积中等的有核上皮细胞，外形呈椭圆形或圆形；体积较小的白细胞，外形呈圆形且透亮。

　　下丘脑-垂体-性腺轴可调节子宫内膜的周期性变化。下丘脑神经内分泌细胞产生的促性腺激素释放激素使垂体前叶分泌卵泡刺激素和黄体生成素 。

　　动情前期，卵泡刺激素可促进卵泡生长、成熟并分泌大量雌激素。动情期，下丘脑和腺垂体抑制卵泡刺激素的分泌、促进黄体生成素的分泌，当两者比例达到一定关系时，卵泡排卵。动情后期，黄体生成，雌激素、孕酮水平下降。动情间期，黄体退化，雌激素和孕酮含量骤然下降。综上所述，大鼠在不同生理周期血液中雌二醇的含量不同，表现为动情后期开始升高，动情前期达到峰值，动情期回到基础值。因此，可以通过检测血液中雌二醇的含量来检验阴道涂片方法的准确性。

　　在本实验中，与动情间期组比较，动情前期组和动情期组血清中雌二醇含量明显升高，动情后期组无明显差异，因此，在动物生殖或内分泌相关实验中，为了不受雌二醇的影响，可选择雌二醇含量较低的动情后期和动情间期的雌性大鼠。根据实验数据可得，动情前期组雌二醇含量最小值为125pmol/L，动情间期组和动情后期组全部小于125pmol/L，动情期组仅有一点大于125 pmol/L，符合雌二醇在生理周期各阶段的变化，因此，采用阴道涂片方法检验大鼠生理周期基本可靠。总之，采用阴道涂片方法检测大鼠生理周期具有可靠、简单、实用等优点。