腹泻是世界范围内最常见 的 感 染 性 疾 病 之一[1].中国疾病预防控制中心2011年发布的报告显示[2],引起腹泻病例的病毒主要包括轮状病毒(Rotavirus A,RVA)、诺如病毒GI和GII型(No-rovirus,NoVGI、GII)、札如病毒(Sapovirus,SaV)、肠道腺病毒(Enteric adenoviruses,EAds)、人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)等.能引起腹泻的细菌包括志贺菌(Shigella),沙门菌(Salmonel-la),副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus),大肠杆菌(Escherichia coli),耶尔森菌(Yersinia),霍乱弧菌(Vibro cholerae)和弯曲菌(Campylobacter)等.
以上这些病原体所造成的腹泻具有相类似的流行特征,无法通过临床症状诊断出确切的病毒或者细菌.
由于缺少病原学证据,这些病例通常被定义为不明原因性疫情.据文献报道,婴幼儿的腹泻病例中的80%都不能得到明确的诊断和鉴定[3].当不明原因性疫情在某个国家或地区出现时,能否在第一时间对病原体的检测分离鉴定,是一个国家传染病应急防控能力和水平的标志[4].因此,建立一种高通量,高特异性,高灵敏度的准确鉴定未知病原体的技术储备是非常必要的.
多重PCR技术(multiplex PCR)在保留了PCR高敏感性这一核心优势的基础上,通过优化多种引物和探针的设计策略以及检测方法,近年来已被广泛应用于消化道多病原的检测.目前已有研究者分别针对腹泻病毒[5-6],腹泻细菌[7-9]和可以导致腹泻的寄生虫[10-11]建立了分子检测方法,市面上也出现了可以同时检测多种腹泻病原体的商业化试剂盒,例如 基 于 液 相 芯 片 技 术 的Luminex xTAG GPP[12]和基于 毛 细 管 电 泳 技 术 的SeeplexR○DiarrheaACE[13].以上这些技术与病毒培养,ELISA,电子显微镜技术,单重PCR等传统的方法相比较,在灵敏度,特异性,时间和费用上都有了明显的优势.但是这些方法的检测通量都相对较低,只能对常见的病原体进行鉴定,无法应对突发疫情.
再测序芯片(RPM)具有传统基因芯片高通量、高灵敏度的优点,同时具备测序能力,具有很高的特异性,于2010年获得了美国FDA的紧急使用授权令(EUAs).中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验 室已 经建立了基 于 呼 吸 道 症 候 群RPM检测呼吸道病毒的方法[14],并对其灵敏度和特异性进行了验证.在一次不明原因呼吸道感染的检测工作中[15],RPM对8例阴性样本进行了筛查,并从5例样本中分别检测到鼻病毒,呼吸道合胞病毒以及副流感病毒.由于呼吸道症候群RPM的良好表现,尽早的建立其他症候群的RPM方法显得尤为重要.
本研究建立了一种基于新型RPM的腹泻症候群多病原检测方法,能同时检测14种轮状病毒,7种杯状病毒,8种星状病毒,28种肠道病毒和16种少见致泻病毒.并且对RPM方法进行了特异性和灵敏度的评估,同时对10份不明原因腹泻的核酸样品进行了检测.
材料与方法
1、试剂 本实验所用试剂的种类和品牌与以前发表的研究相同,详细内容可以参考文献[15].
2、仪器 本实验所用仪器的种类和品牌与以前发表的研究相同,详细内容可以参考文献[15].
3、标本的来源及处理 所有标本均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所腹泻室提供和鉴定,包括15份已知病毒阳性样本和10份病毒阴性腹泻临床样本.轮状病毒的鉴定采用商业化ELISA试剂盒,NoV、EAds、SaV和HAstV的鉴定采用文献中发表 的 方 法[16-18].样 品 为 便 悬 液,用QIAampMiniElute Virus Spin Kit提取,按照产品说明书进行操作,最终的洗脱体积为45μl,分装冻存于-80℃冰箱.
4、引物的验证 以阴性样本为阴性对照,以水为空白对照,以病毒阳性样本为模板,用嵌合引物进行单一模板单一引物的PCR反应.采用Qiagen公司生产的OneStep RT-PCR Kit进行一步法逆转录扩增(RT-PCR),25μl反 应 体 系 为:OneStep RT-PCRBuffer 5μl,dNTP mix 1μl,10mM引物2.5μl,En-zyme Mix 1μl,用Rnase-free H2O补足至50μl,50℃30min,95℃15min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,40个循环;72℃ 10min.将PCR产 物 进行Qiaxcel毛细管电泳,根据峰图或者电泳图的信号强度判断引物的扩增效率.针对不工作的引物,或者扩增效率不好的引物,参考病原体的基因组序列,通过软件Primer Primer 5.0重新设计引物.
5、多重PCR和检测方法 采用SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis System进 行 逆 转 录 反 应(RT-PCR),试剂盒购自Invitrogen公司,20μl的反应体系为:Random hexamers 1μl,10mM dNTPsmix 1μl,RNA 1μl,反应条件为65℃ 5min,冰浴5min;10xRT buffer 2μl,0.1M DTT 2μl,25mMMgCl24μl, 逆 转 录 酶SuperScript III RT 1μl,RNaseOUT 1μl,并用Rnase-free H2O补足至20μl,反应条件为50℃50min,85℃5min.将验证过的嵌合引物分成A(38对引物,包括轮状病毒和冠状病毒)、B(33对引物,包括腺病毒、星状病毒、杯状病毒和小RNA病毒)、C(36对引物,全部为小RNA病毒)共三组,将每组嵌合引物配制成多重混合引物(Primer mix,1μmol/L each),将通用引物配制成10μmol/L,25μl反应体系为:2xQIAGEN Multi-plex PCR Master Mix 12.5μl,上、下游的混合引物各取1.25μl,上、下游的通用引物各取1.25μl,RT产物取2μl,再用Rnase-free H2O补足至25μl.反应条件为:95℃ 15min;94℃ 30s,55℃ 90s,72℃75s,10个循环;94℃30s,67℃90s,72℃75s,10个循环;94℃ 30s,50℃ 90s,72℃ 75s,30个 循 环;72℃10min.用QIAquick PCR Purification Kit对PCR产 物 进 行 纯 化,纯 化 后 用GeneChip Rese-quencing Assay Kit进行片段化、标记,过夜杂交16h,用GeneChip Hybridization,Wash buffer A Band Stain Kit进行洗染,最后用Affymetrix Gene-chip Scanner进行扫描,GSEQ4.0软件进行分析.
6、特异性 用已验证的阳性病毒样本为模板来评估该方法的特异性.包括RPM检测病原谱范围内的RVA,NoV GII,SaV,EAds 41,HastV 1,新肠道病毒71型 (EV71),柯萨奇病毒A16(CV A16)和RPM检 测 病 原 谱 以 外 的 呼 吸 道 合 胞 病 毒(RSV),甲型流感病毒(Flu A),乙型流感病毒(FluB)和博卡病毒(HBoV).
7、灵敏度 以体外转录的RNA(DNA病毒采用重组质粒)评估该方法的灵敏度.以特异性引物扩增靶基因的目的区域,分别针对DNA病毒和RNA病毒,将PCR的 阳 性 产 物 连 接 至PMD18-T或 者pGEM-T载 体,提 取 单 克 隆 质 粒.用RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒对线性化之后的RNA病毒的重组质粒进行体外转录,RNeasy MinElute Cleanup Kit纯化体外转录的RNA,用Eppendorf BioPhotometer核酸蛋白分析仪定量,根据核酸浓度和分子量计算重组质粒或者体外转录RNA的拷贝数.将体外转录RNA梯度稀释至2×105、2×104、2×103、2×102、2×101拷贝/μL,各取1μl作为模板进行RT-PCR,再取2μlRT-PCR产物进行多重PCR,检测单模板的灵敏度.非同日2次平行试验.为了模拟混合感染,将体外转录标准品等拷贝混合,并梯度稀释成2×105、2×104、2×103、2×102、2×101拷贝/μL,其余反应成分和反应程序与单模板反应相同.非同日2次平行试验.
8、临床样本检 将提取的10份便悬液核酸合并成两份混合样品,每份混合样品取2μl进行RT-PCR,再分别取2μl RT-PCR产物加入A、B、C管进行多重PCR,最后将三管产物进行合并,纯化、片段化、标记,用再测序芯片杂交16h进行检测.根据再测序芯片的结果,再对10份样品进行单引物单模板的检测,并对阳性样品进行测序.
结果
1、特异性
对于RVA,NoV GII,SaV,EAds 41和HAstV1,每个反应只出现特异杂交信号,并且能准确鉴定出病原株.EV 71和CV A16检测结果均有EV,CV和埃可病毒(ECHO)的杂交信号,未提示其他病原体.对于RSV,Flu A,Flu B和HBoV,RPM均无杂交信号.
2、灵敏度
多重检测体系单模板和多模板灵敏度试验,重组质粒或者体外转录RNA的检测下限均可达20~2 000拷贝/反应,见表1.
3、不明原因样品检测结果
在第一份合并样品中,检测到NoV GII和EV.
在第 二 份 合 并 样 品 中,检 测 到NoV GII,SaV,HAstV4型.根据芯片结果,再用NoV GII,SaV,HAstV4型的特异性引物对样品进行单重PCR并进行测序,其中NoV GII的引物有三对.用EV的通用 引 物 做 巢 式PCR并 测 序 确 定 其 准 确 血 清型[19].10份不明原因腹泻临床样品中,1份检出SaV GII,1份检出HAstV 4,1份检出CV B3,1份检出ECHO 30,4份检出NoV GII.其中1份为NoV GII,SaV GII和HAstV 4混合感染,5份为单一感染,4份为病毒检测阴性,见表2.
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讨论
本研究中RPM的检测结果与单一引物单一模板的测序的结果完全一致,说明腹泻症候群RPM具有较好的特异性和灵敏度.
方法的建立参考并沿用了本实验室已有的几种技术优势.
①新型再测序芯片检测方法在PCR过程中采用了TSP技术,通过调节不同反应阶段退火温度,使通用引物和嵌合引物分别发挥作用,降低了了不同引物扩增效率不一致造成的扩增偏向性.本实验室已经成功的将这种策略应用于呼吸道症候群[20],腹泻症候群[6],手足口病[21]病原体检测方法的建立并取得了很好的效果.
②将10份样品合并成2份进行芯片检测,再用普通PCR加测序单独检测每一份样品,比每一份样品都用芯片检测的成本降低了80%.再测序芯片提供的样品序列长度为200bp,单重PCR产物的序列长度普遍大于400bp,这使得BLAST比对的结果更加可靠.
高通量是基因芯片一种强大的技术优势,这种优势在对不明原因腹泻样品的检测中得到了验证.
在腹泻症候群RPM的引物体系中,共有三对引物(NoV2A,NoV2B和NoV2C)是针对NoV GII基因组不同区域和位置设计的.多重PCR之后,产物还要进行片段化和杂交等过程,虽然芯片扫描结果为NoV GII,但是产物是由哪一对引物扩增而得到的就无从考证了.本次实验共检出4例NoV GII阳性样本,由表2中的单引物PCR的结果来看,引物A在3例样本的扩增中均发挥了作用,1例样本是由引物B扩增得到的结果,引物C与引物A在1例样本中同时发挥了作用.在PCR反应过程中,由于引物设计不合理,反应条件不合理,基因组变异,都可能造成引物不工作而得到假阴性结果,甚至同一对引物针对不同地域的流行株都有扩增效率的差异.从本次实验的结果来看,单独采用某一对NoVGII的引物对样本进行筛查都会出现假阴性结果,相应的样本也会被鉴定为不明原因腹泻样本.而RPM具有高通量的优势,使得多对引物,多对探针同时检测同一种病原体甚至同一个基因位点得以实现,扩大了检测范围并减小了漏检的概率.
本研究对EV的检测结果进行了分析并对检测流程做了优化.在对腹泻症候群RPM的特异性进行评估时,EV 71和CV A16的阳性样品虽然都能正确的被鉴定为EV,但不同型别之间会出现非特异性的杂交,说明该方法对于EV的鉴定只能精确到属,而不能准确的区分EV的型别和亚型.造成这种结果的原因在于探针和引物的设计,EV的5'-UTR区序列是EV基因组中相对保守的区域,腹泻症候群RPM中EV的探针和引物全部针对该区域设计而成,可扩增EV核酸,准确的检测出样品中是否含有EV.但由于5'-UTR区核苷酸序列和血清型之间无显著相关性,因此不适合EV的分型诊断.
这种针对保守区域设计引物和探针的优点是检测范围广泛,不容易造成目的病原体的漏检,缺点是不能提供更详尽的分型信息.
Ji n L Q[22]等建立了一种针对肠 道 细 菌 的 基 因 芯 片 方 法,以 细 菌 的16SrRNA作为靶基因,对于同在肠杆菌科的沙门菌属,志贺菌属和埃希菌属难以准确鉴别,这与本研究中EV的情况相类似.根据RPM中对于EV阳性的提示信息,本研究采用了巢式PCR和测序的方法对样品进行了符合,分别检测到一份CV B3和一份ECHO 30阳性样本.这使得临床样本的检测结果更加详尽.
美国Tessarae公司推荐的基因芯片阳性判定阈值为20,当某种病原体的C3信号值大于20时即判定为该病原检测阳性[23].为避免非特异性杂交引起的 假 阳 性,Shen[14]等 在 建 立 呼 吸 道 症 候 群RPM方法时,将阳性的判定阈值提高至45(即C3信号值大于45判定为阳性),通过比较再测序芯片和PLEX-ID的检测结果,没有出现假阴性.本次实验在评估各个病原体特异性的同时,通过对参考品RNA和参考品DNA浓度的调整,用不同浓度梯度的参考品摸索了较为合理的阳性判定阈值.结果表明腹泻症候群RPM方法可以将阳性判定阈值调整为60.笔者认为不同的RPM方法之所以需要对应不同的阈值,与样本类型有关.呼吸道症候群RPM检测的原始样本为口腔拭子,而腹泻症候群RPM的原始样本为粪便,虽然采取同样的总核酸提取方法,但粪便样本的成分更加复杂,含有大量的细菌基因组DNA.基因芯片是一种灵敏度很高的检测方法,在核酸的成分更加复杂的情况下,粪便样本会比咽试子样本产生更多的非特异杂交,继而造成背景信号更强,这说明根据不同RPM的情况,适当的调整阳性判定阈值是必要的.
本研究建立了一种基于RPM的检测方法,不仅对其特异性和灵敏度进行了验证,还优化了实验流程.在对10份不明原因腹泻样品的检测中,有4份样品结果依然为阴性,这有可能是细菌或者寄生虫感染所造成的,受来源样本限制(不明原因样品为病毒核酸),本次试验未对这些病原体进行筛查.由于婴幼儿胃肠功能较弱,常常因喂养不当,食物过敏,气候变化等造成非感染性腹泻[24],这也是可能导致阴性结果的一种原因.新方法在其余6份样本中都检测到了致泻病毒,充分体现了该方法高通量,高灵敏度的技术优势,证明RPM适用于传染病疫情中不明原因腹泻样品的检测工作.有了这种技术储备,当不明原因性传染病突发疫情出现时,实验室就可以在很短的时间内发现和明确病原体,为控制疫情赢得宝贵的时间.
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