芦笋育种中生物技术的运用

　　0 引言

　　芦笋是一种全球重要的经济作物，质嫩味美，营养丰富，被誉为"蔬菜之王"[1].近年来芦笋种植及加工业在中国发展迅猛，2012年全国芦笋种植面积已达180 万亩，是世界第一大芦笋生产和出口国[1].但是，芦笋在中国属于舶来品，商业化生产历史短，育种工作起步晚，品种资源匮乏，种子问题上受制于人仍是中国芦笋产业发展的瓶颈之一，亟需加快育种进程，实现良种国产化。

　　芦笋是典型的雌、雄异株作物，繁殖过程中长期异交形成基因型高度杂合，即使品种内单株间也存在较大的差异，难以进行严格意义上的自交，姊妹交基因纯合速度慢。它又是多年生作物，可连续生长10~20年，一般3年后才能测产，需要连续测产3~4年[2].因此，芦笋育种工作复杂，育种周期较长。近二三十年来组织培养技术成功用于芦笋的无性繁殖，加速了优良单株的扩繁和利用，花药培养、DNA分子标记技术以及多倍体诱导等生物技术的应用丰富了育种途径，芦笋育种因而取得较大的成就。本文综述国内外生物技术在芦笋育种研究上的应用，并分析存在的问题，探讨芦笋育种工作的未来发展方向，以期为今后芦笋育种研究工作提供参考。

　　1 组织培养技术与芦笋育种

　　1.1 芦笋茎尖、腋芽离体培养及快繁

　　芦笋最初无性繁殖方式只能采用分蔸法，1株生长3~4年的根蔸只能分割出5~6株，分株率低，繁殖周期长，速度慢，严重制约着芦笋种苗繁殖和品种选育，芦笋组培快繁技术成功应用改变了这一不利局面。诞生于1976年的芦笋第2代品种'UC157',即世界上第1 个无性系杂交品种（Clonal Hybrids），得益于期间芦笋组培技术的应用，彻底克服由于姊妹交引起的品种严重退化，并解决了亲本繁殖问题，从此芦笋品种选育进入了一个全新阶段。

　　早在1968年Wilmar与Hellendoorn[3]在《Nature》上报道了诱导获得芦笋胚状体，并由此培养出完整的芦笋植株，芦笋也成为第1个组织培养成功的单子叶植物。随后，各国研究者通过茎尖分生组织培养[4]、茎段腋芽培养[5],以及愈伤组织器官发生[6]或体细胞胚胎发生[7]等途径研究芦笋组培技术，均成功获得与亲本基因型一致的克隆苗。但是，芦笋在组织培养中属于难生根植物，20世纪80年代以前，一直没有解决组培苗生根难题，因此限制芦笋组培技术的广泛应用。1981年周维燕等[8]通过改变激素种类和浓度配比，将芦笋鸡爪根诱导率由20%~30%提高到了44.4%.Chin[9]、Khunachak 等[10]在生根培养基中加入 GA 抑制剂嘧啶醇（Ancymindol）使生根率提高到 90%~100%.

　　Desjardins 等[11]采用繁殖根丛策略，即首先诱导培养茎段腋芽形成根丛（crown），然后快繁根丛，再诱导生根，极大提高了繁殖系数和生根率。陈光宇等[12]采用繁殖根丛策略和两段法生根培养，使繁殖系数达到5.3以上，生根率达到100%.最近，Carmona-Martín等[13]开发出一种新颖、快捷、高效的天门冬属植物组培快繁方法，以植株根茎芽作为外植体，芽诱导和生根均在根茎芽培养基上，整个系统采用一步法，大约8周即可出瓶移栽，平均成活率达80%.Regalado等[14]

　　进一步优化了该组培快繁方法，以修改的MS培养基作为根茎芽培养基，用85.7 mg/L EDDHA-Fe替代MS培养基中的EDTA-Fe 和维生素，并添加 0.3 mg/L NAA、0.1 mg/LKIN、2 mg/L 嘧啶醇和 6%蔗糖。结果表明：外植体诱导成苗率达70%,一步法生根率为30%~45%;增加一个培养周期生根率提高至60%~85%,增加2个培养周期生根率达到100%;试管苗移栽成活率高于90%.此方法同样适合于芦笋栽培品种组培快繁，生根快，周期短，但可能存在繁殖系数不高、外植体不易消毒等缺点。

　　1.2 芦笋花药培养与小孢子培养

　　芦笋供体雄株Mm产生2种基因型小孢子M和m,运用花药培养或小孢子培养技术进行培养，诱导雄核发育，可培育形成单倍体花粉植株M和m,它们经人工诱导加倍处理或自发加倍形成产生双单倍体植株MM（超雄株）或 mm（纯合雌株），进而培育全雄品种（mm × MM→Mm,子代全部为雄株）和强杂种优势组合，加速基因纯合，缩短育种进程，因此，花培技术在多年生雌、雄异株作物芦笋育种中的作用尤为突出。

　　1.2.1 花药培养 Pelletier[15]首次采用芦笋花药培养成功获得单倍体细胞团（n=10）。随后Dore[16]在Pelletier工作基础上，成功获得单倍体植株，并通过人工加倍法得到超雄株和纯合的二倍体雌株，然后组织培养繁殖DH 单株，雌雄 DH 系配组杂交，获得早熟高产的全雄组合。1985年Falavigna等[17]通过花药培养成功地推出'Eros'、'Ringo'、'Golia'和'Argo'4个优良全雄品种。目前芦笋花药培养技术已成为国际上芦笋全雄品种培育主要途径之一。国内20世纪80年代起，如周维燕等[18]、张磊等[19]、丁鑫等[20]、林宗铿等[21]、陈海媛等[22]先后开展了芦笋花药培养技术研究，对花药培养的外植体取材与预处理，培养基筛选，诱导培养方法，倍性鉴定与移栽，以及控制体细胞干扰等方面进行了研究，已获得花药培养的单倍体和纯合二倍体等花培植株。

　　芦笋花药培养一般以小孢子发育处于单核晚或末期的花药进行接种诱导效果较佳，通常以MS培养基为基本培养基，配以不同的植物生长调节剂组合，诱导雄核发育，通过胚状体或愈伤途径，获得花培苗，其关键是雄核发育的诱导，促进小孢子启动分裂。目前国内较多是通过诱导花药愈伤途径[19-22]获得花培植株。

　　彭新红等[23]则是通过诱导芦笋花药雄核发育胚状体途径获得花培植株，建立了一种效率较高的花药培养诱导胚状体方法，筛选出较优的花药胚状体诱导培养基是MS培养基，另添加0.01 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D、50 g/L 蔗糖。最近 Ercan 等[24]结果表明，小孢子处于单核末期的花药在添加了0.5 mg/L BA和1 mg/L NAA的MS培养基上培养，胚状体诱导率最高，达到8.33%,最后成苗率达到13.33%.

　　1.2.2 小孢子培养 小孢子培养能够较好避免体细胞干扰。闫凤英等[25]对芦笋花粉粒进行离体培养，诱导产生了愈伤组织，经再分化培养形成单倍体植株（n=10）。Zhang 等[26]研究报道，芦笋游离小孢子在添加1.0 mg/L 2,4-D 和 0.5 mg/L BA 的液体 MS 培养基中诱导培养，获得高频率的小孢子胚和愈伤组织；将愈伤转移至添加1.0 mg/L 2,4-D和0.2 mg/LBA的固体MS培养基上培养，6周后获得单倍体再生植株。Peng等[27]

　　研究表明，培养基成分、花蕾低温预处理时间、花药共培养时间等因素均影响芦笋小孢子分裂频率和愈伤组织产率，最优处理是：基因型G459花蕾4℃低温预处理7~9 天，在含 6%蔗糖、1 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA 的液体培养基上共培养花药与游离小孢子14天；4天后2%游离小孢子分裂形成小愈伤组织；每 100 个花药产生约140块愈伤组织；在4种再生培养基上培养，分别有19.6%~21%和3.9%~8.0%愈伤组织产生了幼苗和胚芽；最后成苗的植株中，单倍体占49%、二倍体占34%、三倍体占4%、四倍体占11%.汤泳萍等[28]研究表明，单核晚期是芦笋游离小孢子培养适宜发育时期，小孢子变温预处理效果显着，小孢子启动分裂（膨大率）比对照高出6倍，最高达22.5%,小孢子培养的适宜培养基为添加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA、0.2 mg/L 2,4-D、400 mg/L Glu 和 6%蔗糖的 MS 培养基。

　　1.3 原生质体培养

　　原生质体培养可为芦笋遗传育种创造细胞无性系变异和突变体，为基因工程提供理想的受体，以及奠定细胞融合工作基础。芦笋品种资源遗传背景狭窄，通过原生质体融合有助于克服种间杂交障碍，打破传统育种的限制，引进近缘野生种优异基因，创制优异新种质新材料，培育优良新品种，因此，芦笋原生质体培养是一件非常有意义的研究工作。早在1975年Bui等[29]从芦笋拟叶的叶肉细胞分离得到原生质体，培养形成愈伤组织，并由愈伤组织诱导获得了再生植株。由此，芦笋成为第一个原生质体培养成功的单子叶植物。杨丽军和许智宏[30]利用芦笋胚性愈伤组织作为分离原生质体的起始材料，建立了合适的原生质体培养系统。

　　Chen 等[31]研究表明，KM8P是芦笋原生质体培养比较适宜的培养基，培养 2 天的原生质体植板率可高达20%,约 25%启动分裂的原生质体发育形成体细胞胚，共约0.8%最初分离出的原生质体培养再生出完整植株。尹富强等[32]获得高质量的田间栽植芦笋嫩茎原生质体。Kunitake[33]电击法成功诱导A. macowanii与芦笋栽培种原生质体融合，但获得的体细胞杂种不育。

　　2 分子标记技术与芦笋育种

　　芦笋重要农艺性状多为复杂的数量性状，受微效多基因和环境的共同作用，因此，在遗传改良中对基因型选择的依赖性更为突出。借助现代分子标记技术开展芦笋分子育种，可以显着提高选择效率，缩短育种周期。目前芦笋分子标记技术主要包括以下2个方面。

　　2.1 遗传图谱的构建

　　高密度的分子遗传图谱是目标性状基因（QTL）定位、克隆与分子标记育种等研究的基础。由于芦笋作图群体构建困难等原因，已公开发表的芦笋基因组遗传图谱只有4张。Lewis[34]以2个杂合亲本杂交F1的部分双列杂交群体作为作图群体，运用RFLP标记技术构建了芦笋首张基因组遗传图谱；Jiang等[35]使用同样的作图群体，运用RFLP、RAPD和同工酶标记加密了芦笋第1张基因组遗传图谱；Spada等[36]以2个雌雄双单倍体杂交F1群体作为作图群体，运用RFLP、RAPD、AFLP 和同工酶标记构建了芦笋第 3 张基因组遗传图谱，总共274个标记定位到10个连锁群上，总遗传距离为 721.4 cM,平均遗传距离和最大遗传距离分别是7.9 cM 和 29 cM.Mercati 等[37]采用454平台高通量测序抗、感锈病转录本，检测出符合分析条件的1800个SNP 和 1000 个 SSR 位点，从中开发出基于 EST 的 144个SNP和60个SSR分子标记，利用239个单株BC1群体将81个标记（65个SNP、15个SSR、1个STS）初步定位在13个连锁群上，总遗传距离为773.5 cM,平均遗传距离是10.2 cM.其中上图标记可以用来进行种质资源鉴定与遗传多样性分析。最近Mercati等[38]利用上述144个SNP对国际上广泛使用的花药培养来源的DH 系和品种进行检测分析，结果证实了现代芦笋种质遗传背景相当狭窄，许多 DH 系均带有早期品种'Mary Washington'的血缘。

　　2.2 与重要性状连锁的分子标记开发与应用

　　当前芦笋重要功能基因（QTL）挖掘与标记开发，主要集中于芦笋性别，其他目标性状研究几乎未见报道，由此，芦笋分子标记前景选择仅局限于雌、雄性别。寻找和定位与芦笋性别决定基因连锁的DNA分子标记，国内外先后许多研究报道[39-46],目前构建了围绕芦笋性别决定基因M比较精细的遗传图谱，将M定位在L5染色体着丝点附近的0.63 cM区域内[41],其中开发的部分分子标记已用于雌雄株筛选。国内韩莹琰等[42]运用BSA法筛选芦笋雌雄基因池，获得E-ACG/M-CTT-156 多态性片段与 M 基因连锁，遗传距离为8.33 cM.周劲松等[43]利用前人开发的DNA分子标记Asp1-T7 和 Asp1-T7sp 早期快速鉴别芦笋雌株和雄株，并结合测交筛选出超雄株。李书粉等[44]通过AFLP扩增筛选获得与芦笋雄性连锁的AFLP和SCAR标记。

　　最近 Kanno 等[45]将芦笋一个雄性特异 RAPD 标记T35R54-1600 成功转化为一个 STS 标记 MSSTS710,能 够 鉴 定 8 个 芦 笋 品 种 雌 、雄 性 别 ,即'MaryWashington 500W'、'UC157'、'Harumachi Green'、'Super Welcome'、'F4'、'Pacific 2000'、'F2'和'Backlim'.Patricia等[46]利用雄性连锁标记Asp1-T7和EST-SSR背景选择标记成功从西班牙本土'Moradode Huétor'两性株后代群体中筛选到四倍体超雄株。

　　3 芦笋的遗传转化研究

　　早在l987年Bytebier等[47]将含有氨基糖苷磷酸转移酶（NOS-APH）基因的重组质粒pGV3850:1103neo转化芦笋愈伤组织，经卡那霉素筛选获得再生植株，分子杂交证明外源基因整合至芦笋核基因组上，由此，芦笋成为第一个转基因成功的单子叶植物。目前芦笋农杆菌介导法[47-49]、基因枪法[50-51]、电击法[52-54]等转基因技术已比较成熟。其中，Li 等[51]利用基因枪将 NPTII 和uidA 基因同时转入芦笋悬浮细胞中，获得 10 个转基因植 株 ,在 茎 和 拟 叶 中 均 检 测 到 uidA 表达 .

　　Mukhopadhyay 等[52]利用电击法将NPT II和GUS基因导入芦笋胚性愈伤产生的原生质体中，并获得转基因再生植株。由于芦笋是异交授粉植物，转基因植株后代遗传规律相对复杂。Limanton-Grevet与Julien将含3~4个T-DNA拷贝的6个转基因植株与非转基因植株杂交，获得6株T1植株，分析它们GUS活性和卡那霉素抗性，结果发现：3个T1符合孟德尔一对基因1:1分离比例，且T-DNA插入在T0代相同的位点，其他3株则呈现非孟德尔分离；T2代也表现非孟德尔分离；无GUS 活性和卡那霉素抗性的植株，并不含有任何 T-DNA,不适合用来分析非孟德尔分离。但由于芦笋是蔬菜，涉及到食品安全等问题，国内外尚无转基因芦笋品种问世。从长远发展角度看，国内有必要开展芦笋转基因技术研究储备工作。

　　4 多倍体育种

　　芦笋染色体基数x=10,栽培品种多为二倍体（2n=2x=20），但生产也有些多倍体品种，如紫色四倍体品种'Purple Passion'、'Pacific Purple'、'Sweet Purple',绿色四倍体品种'Seto Green',三倍体绿芦笋品种'Hiroshima Green',它们一般比二倍体品种植株高大，嫩茎粗壮，笋商品性好。由于芦笋属于茎菜，以植物体嫩茎为主要收获对象，多倍体细胞遗传学缺陷影响小，且染色体基数较少，多倍体育种潜力较大。

　　秋水仙素是在芦笋多倍体诱变中应用较多的化学诱变剂。Braak 等[56]、Skiebe 等[57]以秋水仙素为诱变剂，处理萌发的芦笋种子，均成功获得四倍体芦笋植株。韩成云等[58]以秋水仙素为诱变剂，用浸泡法和涂抹法处理芦笋试管苗，进行多倍体诱导。结果表明：以0.10%秋水仙素为诱变剂，用涂抹法处理 72 h 的效果较佳，形态学分析显示其加倍率可达94%;对多倍体材料进行染色体鉴定，涂抹法染色体加倍效果（细胞加倍率96.1%）也优于浸泡法（细胞加倍率86.4%）。最近Carmona-Martin 等[59]使用秋水仙碱溶液处理西班牙本土四倍体品种'Morado de Huetor'根茎芽，成功获得八倍体植株，其中0.1%秋水仙碱溶液80 r/min旋转震荡处理 24 h 效果最佳，八倍体诱导率达 7%,混倍体3.5%,获得的八倍体植株在株高、笋粗、冠层面积等农艺性状显着优于原始四倍体植株。

　　芦笋多倍体育种另一途径是通过种间杂交或者不同倍性品种间有性杂交分离获得。Moreno等[60]研究发现，西班牙本土品种'Morado de Huetor'具有丰富的染色体倍性变异，包括2n=2x,3x,4x,5x,6x,8x等植株，但以四倍体植株为主，这因为'Morado de Huetor'属于四倍体的芦笋栽培品种与A. maritimus种间杂种，可以从分离出遗传稳定的多倍体植株。Moreno等[61]利用芦笋四倍体品种与二倍体品种相互杂交，从杂种后代中分离获得整三倍体植株。

　　5 小结与展望

　　综上所述，现代生物技术在芦笋遗传育种中研究应用起步比较早，在单子叶植物中3项第一，芦笋也堪称为早期模式单子叶植物，芦笋育种生物技术已取得较好的成就，并成为芦笋种质创新与品种改良的重要手段，但是仍存在着一些问题：

　　（1）进入21世纪，芦笋原生质体培养、遗传转化以及小孢子培养等生物技术研究报道很少，甚至呈现停滞状态，至今尚无转基因芦笋品种问世，芦笋原生质体融合成功实例也极少。

　　（2）国外先后报到了芦笋病毒病AV-1[62]、AV-2[63]、AV-3[64],亟需尽快开展芦笋脱毒快繁技术研究。

　　（3）国内花药培养研究报道不少，实践中也获得了单倍体、双单倍体植株，但成功应用于全雄育种的实例并不多。

　　（4）分子标记技术在芦笋上的应用仍落后于其他园艺作物，现有的遗传图谱密度过低，分子标记少，除了雌、雄性别，缺乏与其他目标性状连锁的分子标记。

　　鉴于此，并根据芦笋生物学特性和产业发展需求，建议今后芦笋生物技术育种工作中重点关注以下方向的研究：

　　（1）以拓宽遗传背景为重点进行种质创新，积极开展芦笋种间杂交技术研究，将近缘野生种质优异性状导入栽培品种，综合运用组培快繁、花药培养和DNA分子标记辅助选择等生物技术，提高杂种后代目标基因型选择效率，加快基因纯合速度，培育生产中亟需的抗茎枯病、富含功能活性物质等新种质新品系。

　　（2）国内芦笋花药和小孢子培养研究，应致力于解决体细胞干扰、诱导率低、鉴定困难以及移栽成活率低等难题，切实建立起一套可操作性强、行之有效的芦笋花药和小孢子培养技术体系，并与芦笋全雄品种和杂种优势利用实践紧密结合。

　　（3）鉴于芦笋多年生和雌雄异株等生长繁殖习性，人工种子将有良好的应用前景，加强基于体细胞胚发生途径的组培快繁技术研究，提高体细胞胚诱导率，控制体细胞变异，在此基础上研发芦笋人工种子，可能是芦笋组织培养未来发展方向之一。

　　（4）芦笋基因组测序已完成，精细的基因组图谱即将公布，以此为研究平台，积极开发前景和背景选择标记系统，走向基因组辅助育种和分子设计育种，并融合传统育种，将是芦笋新品种培育必然的发展趋势。

　　参考文献：
　　[1] 陈光宇。中国芦笋产业发展现状与趋势[J].世界农业，2013,10:181-186.
　　[2] 王小佳。蔬菜育种学（各论）[M]. 北京：中国农业出版社，2000: 241.