茄子NAC1转录因子的分离及表达研究

　　NAC（NAM、ATAF 和 CUC）转录因子是高等植物特有的一类数量较多的转录因子，其 N 端都包含一段约 150 个氨基酸残基的保守序列，在植物生长发育、器官建成、胁迫应答以及品质改良过程中发挥着重要作用（邵凤霞 等，2008），已成为当前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点（Zheng et al.，2009）。第一个 NAC 基因 NAM 是 Souer 等在 1996 年从矮牵牛中克隆到的（Soueret al.，1996），随后 1997 年 Aida 等（1997）在拟南芥中发现了 NAM、CUC2 和 ATAF1/2 等 3 种基因，CUC2 功能类似于 NAM，与植物的发育相关；ATAF1/2 的功能与植物逆境应答相关。

　　目前研究表明：NAC 转录因子在水稻基因组中有 151 个成员，烟草（Rushton et al.，2008）和大豆（Le et al.，2011）中均有 152 个，拟南芥中有 117 个（邢国芳 等，2012）。李雪林等（2010）根据水稻的 SNAC1 是抗逆性转录因子（Hu et al.，2006），且在非生物逆境胁迫（干旱、盐渍）下 SNAC1的表达可以提高抗逆性，将其导入棉花后通过 NaCl 胁迫筛选出了棉花转化体系。李鹏（2011）研究了棉花中多种 NAC 基因及其受各种胁迫时的表达，发现 GhNAC1 在棉花纤维中特异表达，其它NAC 转录因子在各个组织中均有表达，且 GhNAC12 明显受低温胁迫的诱导，GhNAC20 明显受低温、高盐和 PEG 处理诱导，GhNAC16 主要对高盐处理敏感。玉米 ZmNAC1 可以被低温、PEG、高盐和ABA 诱导（柳展基 等，2009）。细菌性斑点病菌侵染辣椒后 CaNAC1 被快速诱导，而在非寄主病菌侵染与抗病信号分子 SA 和 ET 处理辣椒后 CaNAC1 的诱导表达也很强烈（Oh et al.，2005）。

　　在中国北方地区，设施栽培中的低温弱光是生产中最大的限制因素（闫世江 等，2010），土壤次生盐渍化也较为严重（史庆华 等，2004；张海军 等，2013）。茄子（Solanum melongena L.，2n = 2x =24）是设施栽培的主要蔬菜，目前关于茄子耐寒性（高志奎 等，2000；任国三 等，2007；王锋，2008）、耐盐性（吴雪霞 等，2010，2011）已有一些报道，但主要是研究其对生长发育过程中生理指标的影响，而有关茄子抗逆性基因分子育种的研究较少。作者从茄子中分离鉴定出 NAC1 转录因子全长，对其在逆境胁迫下时空表达模式做出初步分析，以期为茄子抗逆性分子育种奠定基础。

　　1、 材料与方法

　　1.1 材料及其处理

　　选用北京农学院蔬菜育种课题组选育茄子品系 ETC01，于 2012 年 7 月中旬播种于塑料大棚，待幼苗长出 2 ~ 3 片真叶时摘取所有幼苗叶片，混合后每份 1 g，用锡纸包成若干份，液氮速冻，置于–80 ℃冰箱储存备用。

　　2013 年 6 月中旬将茄子种子播种于直径 15 cm 的营养钵内，营养基质为草炭︰蛭石 = 1︰1（体积比）。营养钵放置于北京农学院农业生物组织培养实验室中培养，待幼苗长到 2 ~ 3 片真叶时进行不同因素处理。（1）配制浓度 50 mg · L-1GA 溶液，每个营养钵中加入 200 mL；（2）低温 4 ℃处理，每个营养钵中加入 200 mL 蒸馏水后将整个营养钵置于 4 ℃的培养箱中；（3）配制浓度为 20 g · L-1的NaCl 溶液，每个营养钵中加入 200 mL。每个因素处理 3 个营养钵（每个营养钵 20 ~ 25 株幼苗），在 0 ~ 12 h 内定时取各处理的根、茎、叶样品，液氮速冻，置于–80 ℃冰箱储存备用。各处理均设加入 200 mL 蒸馏水的 1 个营养钵（20 ~ 25 株幼苗）作为处理 0 h 的对照。

　　1.2 SmNAC1 序列克隆

  采用 UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 提取试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）提取茄子总 RNA，用 DNaseⅠ（TaKaRa）去除总 RNA 中基因组 DNA 的污染，用 RW1（博迈德）去除总RNA 中的蛋白污染，最后用 Thermo 公司的 NANODROP 2000 检测其浓度并采用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。以提取的总 RNA 为模板合成 cDNA，cDNA 合成体系的总体积为 20 μL，反应过程为：总 RNA 和 10 μmol · L-1Oligo（dT）18 混合液于 70 ℃水浴 10 min；然后加入 ReverseTranscriptase M-MLV 反转录酶（200 U · μL-1）、dNTP（10 mmol · L-1）、RNase Inhibitor（40 U · μL-1）及灭菌的双蒸水，置于 42 ℃保温 60 min，后于 70 ℃变性 15 min，最后存于–20 ℃冰箱作为基因扩增及实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）的模板备用。

　　在 NCBI 中搜索，根据 GenBank 中已公布的辣椒 NAC（AY714222）、甘蓝型油菜 NAC1（AY245879）、番茄 NAC（AY573802）、番茄 NAC1（NP_001234482.1）设计兼并引物扩增 SmNAC1的保守区。上游 S1：CAYCCDACKGAYGAAGA，下游 A1：TTCTTSTTGTADATTCGACA。

　　采用 Clontech 的 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 分别克隆 SmNAC1 的 3′端和 5′端序列，用Primer Primier 5.0设计特异引物3′S：GCTGGAAAAGCACCAAGAGGAAT和5′A：GGTTCCTGCTGCTCGGTTCGGC；UPM 通用引物 Long：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，Short：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，由 RACE 扩增试剂盒提供。94 ℃预变性 4 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25 个循环；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

　　利用 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒（上海生工）将扩增产物回收，凝胶电泳检测后，用北京全式金生物技术公司 pEASY-T3 Cloning Kit 连接，转化于 Trans1-T1 感受态细胞，蓝白斑筛选，经菌液 PCR 初步鉴定后送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。最后根据 DNAMAN 软件拼接序列获得茄子 SmNAC1 全长 cDNA 序列。根据拼接出的序列利用 Primer Premier 5.0 设计特异性引物QS：AAAATAAACAGCGAAGAGAGA；QA：CTACACCAAAAAACCAAGAAA 扩增 SmNAC1 全长，同样将扩增产物回收、连接、转化、筛选后送测序。

　　1.3 实时荧光定量 PCR

　　采用 SYBR Green 荧光染料法，用 CFX96（Bio-Rad）实时荧光定量 PCR 仪对 SmNAC1 在不同处理下的时空表达进行检测分析（Ficko & Cernelc，2005）。扩增目标基因 SmNAC1 的上游引物SmNAC1-S：CTTGAGGCTTGATGAATGG 和下游引物 SmNAC1-A：GTGGTAATTGTGTGGGTAAA。

　　茄子内参基因（宋琴，2011）Smβ-ACTIN（GenBank 登录号：GU984779）的引物 Smβ-S：GTCGGAATGGGACAGAAGG；Smβ-A：CAGTCAGGAGAACAGGGTG。按照宝生物公司试剂盒Real Master Mix（SYBR Green）PCR 操作步骤进行，将反转录所得的 cDNA 分别进行梯度稀释（1、1︰10、1︰100、1︰1 000、1︰100 000）进行荧光定量 PCR 反应，绘制相对标准曲线。标准样 cDNA和待测样均设 3 次重复。

　　RT-qPCR 扩增的反应体系为 20 μL，包括 10 μL Real Master Mix 混合液、2 μL cDNA、0.5 μLSmNAC1-F（10 μmol · L-1）、0.5 μL SmNAC1-R（10 μmol · L-1）、7 μL ddH2O。反应程序为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 20 s，53 ℃退火 25 s，72 ℃延伸 20 s，每次循环第 3 步进行荧光采集，40 次循环。内参基因的 PCR 扩增的反应体系为 20 μL：10 μL Real Master Mix 混合液、2 μL cDNA、0.5 μL Smβ-S（10 μmol · L-1）、0.5 μL Smβ-A（10 μmol · L-1）、7 μL ddH2O。其反应程序与 SmNAC1的反应程序相同。

　　2、 结果与分析

　　2.1 SmNAC1 序列的获得

　　对扩增产物分别进行回收、克隆、鉴定后测序，得到长 426 bp 的中间序列，Blast 在线对比后初步证实是 NAC 基因家族，含有 NAC 家族保守结构域。根据上述保守序列设计的特异性引物，最终获得 794 bp 长的 3′端 cDNA 片段序列（图 1，a）、长 396 bp 的 5′端 cDNA 片段（图 1，b）。利用引物 QS 和 QA 特异性扩增出茄子 SmNAC1 全长基因（图 1，c），测序结果显示 cDNA 全长序列为1 279 bp，NCBI 在线分析同源性后，命名该基因为 SmNAC1（登录号：KF668813）。

　　该基因含有1个编码302个氨基酸的完整开放阅读框，序列如图2，起始密码子ATG位于124 bp，终止子 TAG 位于 1 032 bp 处。利用 DNAMAN 推测氨基酸序列与其他物种 NAC 家族序列进行多重序列比对（图 3）：茄子 SmNAC1 含有 NAC 家族共有特点，即 N 端都包含一段保守的氨基酸序列，约 150 个氨基酸残基，保守域包含 A、B、C、D、E 等 5 个亚结构域。

　　2.2 SmNAC1 蛋白的序列分析及结构预测

　　Protparam 在线分析显示：茄子 SmNAC1 蛋白由 20 种基本的氨基酸组成，其分子式为C1570H2376N430O461S12，其中含量最高的氨基酸是 Lys（7.6%）、Pro（7.6%），含量最低的氨基酸是 Cys（1.3%），酸性氨基酸（Asp + Glu）总数为 38 个，碱性氨基酸（Arg + Lys）总数为 40 个，预测相对分子量约为 35.04 kD，理论等电点为 8.18，总平均亲水性（GRAVY）为–0.858，不稳定指数 37.02，推测其属于稳定蛋白。

　　利用 NPSA 中的 MLRC 方法预测其二级结构：SmNAC1 蛋白包含有 63 处 α–螺旋（Alpha helix），占 20.86%，41 处延伸链（Extendedstrand），占 13.58%；198 处无规则卷曲（Randomcoil），占 65.56%。运用 TMHMM Server v.2.0 预测此蛋白无跨膜 区 域 ， PSORT WWW Server 中 PSORTPrediction 工具预测细胞定位于细胞质中。在蛋白质结构数据库中搜索到其同源模型，利用网站Expasy 中 Swiss Model 程序同源建模，推测蛋白的三维结构模型如图 4。

　　2.3 SmNAC1 与其他物种 NAC 的同源性及系统进化树分析

　　将 SmNAC1 蛋白序列通过 NCBI 中 BLAST 在线分析同源性，结果表明 SmNAC1 与番茄 NAC1（NP_001234482.1）、马铃薯（CAC42087.1）、番茄 NAC2（ADL60119.1）、甜椒（AAW48094.1）、烟草（ADQ08688.1）的同源性分别为 90%、90%、89%、84%和 82%。

　　进一步通过 DNAMAN 软件将 SmNAC1 与 GenBank 数据库中已经登录的 14 种 NAC 氨基酸序列构建系统发育树（图 5），可见茄子 SmNAC1 与番茄、马铃薯、烟草亲缘关系最近，与拟南芥 ATAF2在进化上有相同的起源，与矮牵牛、拟南芥 CUC2、CUC1 亲缘关系较远，推测茄子 SmNAC1 同样具有 ATAF2 与植物逆境应答相关的功能。

　　2.4 SmNAC1 在不同处理下的时空表达分析

　　通过 RT-qPCR 对内参基因引物（Smβ-S、Smβ-A）和 SmNAC1 基因特异性引物（SmNAC1-S、SmNAC1-A）进行鉴定，熔点曲线图显示内参基因和 SmNAC 均只有 1 个峰，Tm值分别为 82 ℃和76 ℃，表明内参基因和 SmNAC1 所用引物都具有高度特异性，制作标准曲线显示内参基因的 PCR扩增效率和相关系数分别为 90.8%和 0.997；SmNAC1 的扩增效率和相关系数分别为 112.5%和 0.997，表明试验具有较高的重复性和扩增效率。最后将荧光定量 PCR 扩增产物凝胶电泳检测均是目的片段，无引物二聚体。

　　用 50 mg · L-1的 GA 处理茄子幼苗，实时荧光定量 PCR 检测根、茎、叶中 SmNAC1 的相对表达量（图 6）可见：随着时间的变化 SmNAC1 在根、茎、叶中均有表达，同时在短时间内表达量都上升达到最大值，处理后 0.5 h，在根和茎中的表达量与 0 h 时相比，大约分别增长 4 倍和 8 倍，随后下降到较低水平，甚至低于 0 h 时表达量后又有所恢复；而叶片中在处理 1 h 时达到最高，与 0 h 时相比约为其 2 倍，整体表达量随时间变化波动趋势较小，约在 0.8 ~ 1.5 间波动。

　　4 ℃低温胁迫下，SmNAC1 在根、茎、叶中都有表达（图 7）；0.5 h 时根中的相对表达量下降到最低，茎和叶中都较 0 h 升高；整体上都随时间的延长而升高，说明在不同器官中低温胁迫处理对SmNAC1 的表达都有一定的诱导作用，如在根和叶片中，胁迫 9 h 时其相对表达量达到最大值，在茎中处理 6 h 时表达量水平最高。

　　由图 8 可知，在 20 g · L-1的 NaCl 胁迫下，茄子根、茎、叶中 SmNAC1 都有表达，根中的表达量变化较大，茎和叶中波动较平缓。在根中处理 1 h 时 SmNAC1 的相对表达量由 0 h 的 0.95 达到峰值 4.26，可见 SmNAC1 在根中短时间迅速的诱导表达，随后处理时间延长其相对表达量降低；在茎中处理 1 h 时相对表达量有所升高，6 h 时达到最大值 1.95，随后降低；在叶片中 9 h 时达最大值 1.32，其整体在 0.59 ~ 1.32 范围波动。

　　由上述结果可见：在茄子根、茎、叶中 SmNAC1 均能表达，说明此基因编码的蛋白是一种在茄子根、茎、叶各器官普遍存在的转录因子；外源 GA 和非生物胁迫处理后表达量均发生变化，基本呈先增后降的趋势，初步认定 SmNAC1 是一个可诱导表达的转录因子；而在这些不同器官中 SmNAC1表达的水平不同，根中的表达水平整体相对高于茎和叶片中，显示在根中优势表达，而叶片中表达水平相对稳定，可见该转录因子在不同器官发育过程中所起的作用有一定差异。

　　3、 讨论

　　NAC 作为植物中最大一类转录因子，不仅参与植物生长发育过程的调控、激素调控，而且在植物抗病、抗非生物胁迫应答中也具有重要的生物调控功能。本研究中从茄子中克隆出全长 1 279 bp的 SmNAC1 基因，编码含有 302 个氨基酸的完整开放阅读框，含有 NAC 家族经典保守区域，包括A、B、C、D、E 亚结构域，可能负责与 DNA 及其它蛋白结合（Ernst et al.，2004），软件预测相对分子量约为 35.04 kD，理论等电点为 8.18，推测其为稳定蛋白。综合氨基酸序列同源性分析及系统进化树分析，SmNAC1 与番茄、马铃薯、烟草亲缘关系最近，与拟南芥 ATAF2 在进化上有相同的起源，可能具有 ATAF2 与植物逆境应答相关的功能。

　　有研究显示，拟南芥中 NAC1 特异介导其侧根发生过程中的生长素信号，表达强度与生长素浓度、侧根原基的发生量呈高度正相关，并发现其编码区上游 l kb 范围内含有 3 个赤霉素反应元件（GAresponse complex），存在受赤霉素作用的特征（Xie et al.，2000）。烟草 NAC1 也在根尖、侧根原基特异性表达，王友华（2005）验证了该基因的表达受生长素诱导并且进一步量化了生长素和赤霉素对其的表达的诱导效应。本研究中检测了外施 GA 后茄子不同器官的 SmNAC1 的相对表达量，同样验证了赤霉素能够诱导茄子 SmNAC1 的表达，并且由于与烟草的同源性很高，同样在根中诱导表达水平较高，但是并非只在根中特异性表达，茎和叶中均有表达，且在茎中诱导表达变化趋势与根中相似，而在叶中表达基本维持稳定水平。有报道称拟南芥中存在具有泛素连接酶活性的 SIAT5 蛋白，能将 NAC1 泛素化，而将 NAC1 蛋白迅速降解，研究显示 SINAT5 过量表达后，可通过泛素化将NAC1 蛋白的快速降解（Xie et al.，2002）。这可能是造成本研究中 SmNAC1 在根和茎中表达量迅速先增后降最后基本恢复到原来水平的重要原因。

　　孙利军等（2012）分析了水稻 OsNAC 家族基因在高盐、干旱、低温胁迫后的表达水平，发现45 个盐胁迫响应 OsNAC 基因中 33 个上调表达，12 个下调表达，44 个低温胁迫响应 OsNAC 基因中31 个上调表达，13 个下调表达，过量表达 SNAC1 转基因水稻提高耐盐性同时增强抗旱能力，结实率提高 22% ~ 34%，过量表达 OsNAC6/SNAC2、OsNAC5、ONAC045 和 OsNAC10 基因后能显著提高水稻对干旱、高盐的耐受力。本研究中用 4 ℃低温及 20 g · L-1NaCl 胁迫茄子幼苗，检测不同器官（根、茎、叶）中 SmNAC1 均有表达，虽然显示在根中的优势表达，但可以看出 SmNAC1 在茄子中是一种普遍存在的可诱导表达的转录因子，受到低温、高盐的非生物胁迫后显示上调表达。

　　SmNAC1 可能参与了茄子对低温和高盐胁迫的耐受调节过程，初步预测过量表达 SmNAC1 可能提高茄子对低温和高盐的耐受性，为后续茄子非生物胁迫遗传育种研究奠定了一定的理论基础。