耐冬山茶(Camellia japonica)系指分布于青岛地区的山茶野生种群或栽培群体,为山茶科山茶属常绿小乔木或灌木,作为第三纪残遗植物,此群体具有丰富的遗传变异性.耐冬山茶可耐-10℃以下低温,是我国北方地区珍稀的室外冬春两季开花常绿植物,观赏价值极高[1].目前耐冬山茶仅分布于山东青岛及附近岛屿,野生植株只有几千株,栽培植株数量也不甚多[2].对于这个古老、珍贵的观赏种群,在园林中应用越来越广泛,因此,扩大耐冬山茶的种质资源数量是目前育种工作的重点.组织培养技术是快速、高效繁殖山茶的重要途径.山茶组织培养的方式主要为外植体材料(芽、茎段、叶片和子叶等)的愈伤组织 直 接 和 间 接 诱 导等[3,4].耐冬山茶未成熟胚胚状体培养再生繁殖体系(也称体胚培养)是通过胚状体直接诱导或愈伤组织间接诱导,可在较短的时间内获得再生频率高的植株,成本低,有利于种质资源保存、大规模生产耐冬山茶及实现外源基因的遗传转化[5].相比直接诱导胚状体方式,通过胚性愈伤诱导的胚状体可形成数量较多的植株,其中胚性愈伤的形成是诱导胚状体的关键环节.本实验采用不同激素组合,对不同时期采集的耐冬山茶不同部位幼胚进行胚状体和胚性愈伤诱导,分析最适宜产生胚状体和胚性愈伤的条件,为耐冬山茶胚状体再生繁殖体系奠定基础.
1 材料与方法.
1.1 实验材料.
实验所用的耐冬山茶植株栽植于青岛市植物园实验田内,2012年4月进行异花授粉,8~9月分别采集授粉后15周、17周、19周和21周的幼果,以剥除果皮和种皮后分段的幼胚作为外植体.
1.2 培养方法.
1.2.1 不同实验材料组合.
授粉后13周左右,耐冬山茶幼胚基本成型,可以进行分段培养.为排除胚芽生长的影响,分别将授粉后15周、17周、19周和21周的幼果内幼胚去除上端胚芽部分,留取中段和下端部分,每部分再平均分成4块,接种于诱导培养基上进行培养.每瓶接种一类幼胚(4个小块),每类幼胚接种10瓶.
1.2.2 不同激素配制组合诱导 培养基 的基本培养基为MS,附加蔗糖30g/L,琼脂粉8g/L.培养基配方以诱导胚状体为主进行设计,不同的激素组合如表1所示.培养基调pH至5.8,121℃灭菌20min.
表1诱导耐冬山茶胚状体和胚性愈伤的激素组合.
1.2.3 外植体消毒和培养采来的幼果先用流水冲洗干净,再小心剥出种子,自来水冲洗干净后放入无菌水中.在超净工作台中,处理过的种子先用75%酒精浸泡20s,再用无菌水冲洗2遍,然后使用0.1%的HgCl2消毒浸泡7min,最后用无菌水冲洗5~6遍.将分段的幼胚接种于不同组合的培养基中,在培养温度为25℃、光照光强为2500~3000lx的培养室中培养,光照时间为12h/d.每7d观察一次,30d后统计产生胚状体和胚性愈伤的数量及产生胚状体/胚性愈伤的幼胚块数量.
2 结果与分析
幼胚接种1周左右开始膨大,2周左右开始出现胚性愈伤,胚性愈伤呈现淡黄绿色,生长较一般的愈伤组织缓慢,质地松软,表面有瘤状凸起,细胞排列紧密.3周左右就能够区分直接诱导的胚状体和愈伤组织,此时的胚状体基本发育到子叶胚阶段,颜色为淡黄绿色或乳黄色(图1).在对出现胚性愈伤和胚状体的幼胚块进行统计的基础上,还进一步确定了产生这两类组织的具体数量.其中胚性愈伤根据耐冬山茶中诱导出现的形态特点,以组团为单位进行了统计.
2.1 授粉15周后的胚状体和胚性愈伤诱导
从表2可看出,对于胚状体诱导率最高的组合为1.0mg/L 6-BA激素培养基对于末段幼胚诱导和1.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA诱导末段幼胚,最低诱导率出现在添加1.0mg/L IBA激素培养基对中段幼胚的诱导组合中.在对胚性愈伤诱导中,诱导率达60%以上的激素配方和幼胚部位组合包括5.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA诱导末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA、1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA诱导中段幼胚,1.0mg/L 6-BA对中段幼胚诱导率高达75%.
表明,较低浓度的6-BA及其与NAA组合对早期幼胚胚状体诱导率效果较好,而6-BA与较低浓度IBA组合有利于胚性愈伤的诱导.
2.2 授粉17周后的胚状体和胚性愈伤诱导
授粉17周后采集的幼胚接种后,对于胚状体的诱导率最高的组合仍然是1.0mg/L 6-BA和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA对于末段幼胚的诱导,但总体数量较授粉15周后接种的幼胚增多(表3).添加1.0mg/L 6-BA激素的培养基上诱导的末段诱胚和5.0mg/L 6-BA+ 0.5mg/L IBA诱导的中段幼胚所产生胚性愈伤的块数最多,在6-BA+NAA的两种激素组合中的培养基中和0.5mg/L IBA激素的培养基中对于胚性愈伤的诱导率最低.这再次证明了6-BA、NAA和IBA的不同组合对于耐冬山茶幼胚的作用效果差异明显.
2.3 授粉19周后的胚状体和胚性愈伤诱导.
和前两次诱导胚状体组合不同的是,19周接种的幼胚胚状体数量除在有1.0mg/L 6-BA激素诱导的 末 段 幼 胚 中 最 高 外,在1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA激素诱导的中段和末段幼胚中也很高(表4).但胚性愈伤的诱导率总体上较前两次的数量略有降低,最高诱导率出现在2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA激 素 组 合 的 幼 胚 中 段 部 位 和1.0mg/L 6-BA的幼胚末段部位.
2.4 授粉21周后的胚状体和胚性愈伤诱导.
此阶段对于胚状体的诱导率表现趋势和15、17周的类似,只是数量上有所上升,添加1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA激素的MS培养基对于末段幼胚的胚状体诱导效果最佳,其次为1.0mg/L 6-BA的激素对于末段幼胚的胚状体诱导可达45%以上,对胚状体诱导率最低的激素组合为仅添加生长素的两种不同浓度IBA的配方(表5).大于60%的胚性愈伤的诱导组合为5.0mg/L 6-BA+ 0.5mg/L IBA诱导末段幼胚和2.0mg/L 6-BA+ 1.0mg/L IBA诱导幼胚中段部位.3结论3.1接种时间对胚状体和胚性愈伤的诱导.
从4个不同接种时期对于耐冬山茶的胚状体和胚性愈伤的诱导情况来看,随着幼果成熟时间的延长,8个不同的激素组合对于胚状体的诱导率基本呈现上升的趋势,这表明发育成熟度高的幼胚对于胚状体的诱导能力较强.但胚性愈伤的诱导效果与幼果成熟度关系不太大,这可能与授粉后15~21周幼胚发育成熟度较一致有关.
3.2 激素对胚状体和胚性愈伤的诱导.
耐冬山茶胚状体在含有1.0mg/L 6-BA的培养基上,未成熟胚较易形成胚状体,其中单独添加1.0mg/L 6-BA的培养基和1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA组合的培养基总体对胚状体的诱导率最高.浓度大于2.0mg/L 6-BA的培养基对于胚状体形成不利.单独添加IBA的培养基对于胚状体诱导效果最弱.添加稍高浓度的6-BA+IBA的组合及低浓度的6-BA培养基对于耐冬山茶胚性愈伤的诱导效果最佳,2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/LNAA的激素组合和0.5mg/L IBA对于胚性愈伤形成影响效果最低.由此可见,胚状体诱导需要较低浓度细胞分裂素和生长素的协同作用,胚性愈伤的形成则需要稍高浓度的细胞分裂素的促进.
3.3 外植体部位对胚状体和胚性愈伤的诱导
总体来看,耐冬山茶胚状体在幼胚的末段部位发生较多,而胚性愈伤在幼胚的中段部位较易形成.
胚状体一般一个幼胚段只有1~2个,但胚性愈伤在每个幼胚段上的数量呈组团状分布,数量较多.胚性愈伤接种到体胚诱导培养基上,极易形成胚状体,可以快速获得大量的胚状体再生植株.同时,研究中还发现幼胚表面形成的胚状体较切口面为多,但胚性愈伤多在切口处形成.
4 讨论
耐冬山茶果实成熟的时间为10月份左右,授粉12周以内的幼胚尚未凝固成型,不利于区分不同部位进行诱导.本实验中授粉15~21周的幼果处于8月上旬至9月上旬,此期间幼胚已经成型,子叶表皮细胞分化能力较高,因此胚状体的形成能力也较强.
植物组培过程中,褐化现象比较普遍,耐冬山茶在诱导胚状体过程中未出现明显褐化现象,但在幼胚切口边缘的愈伤组织 呈现梅红色,这可能与物种特异性有关,有待于进一步的解剖观察分析[6].
在对 山 茶 属 植 物 胚 状 体 研 究 中,茶 梅 (C.sasanqua)、防 城 金 花 茶 (C.chrysantha var.longistyla)等多个物种胚状体都是在1.0mg/L 6-BA +低浓度NAA的激素组合条件下易诱导发生,但发生率一般都在50%以下[7-9].这和本实验对于胚状体直接诱导的结果相似,只是物种不同,激素浓度有所差异.在对茶树(C.sinensis)体胚研究中发现,在胚状体诱导培养基中附加一些渗透调节剂,如500~1000mg/L甜菜碱,体胚的发生率会提高[10].实验中,耐冬山茶胚性愈伤的诱导率普遍较高,间接诱导的胚性愈伤可以再进一步诱导为胚状体,这比直接诱导胚状体更能够获得更多的再生苗.在 对 金 花 茶 体 胚 愈 伤 组 织 诱 导 中,MS +1.5mg/L 2,4D +0.5mg/L KT的培养基中愈伤组织诱导率高,这与本实验采用的组合差异有所不同,耐冬山茶中对于其他激素组合诱导培养基还有待于尝试[11].目前山茶属中对于其他物种胚性愈伤的诱导培养基配方报道较少,本实验可以为山茶属植物通过胚性愈伤诱导的胚状体快速繁殖方式提供参考.
参考文献:
[1]王仁卿,张治国,石竹,等.青岛山茶的多样性研究Ⅲ.生态学分析[J].山东大学学报(自然科学版),1999,34(1):109-116
[2]王奎玲.耐冬山茶种质资源研究[D].北京:北京林业大学博士学位论文,2006:25-26
[3]Ponsamuel J,Samson N P,Ganeshan P S,et al.Somatic embryo-genesis and plant regeneration from the immature cotyledonarytissues of cultivated tea(Camellia sinensis(L).O.Kuntze)[J].Plant CellReports,1996,16(3-4):210-214
[4]董慧慧,王奎玲,薛秋华,等.耐冬山茶愈伤组织诱导研究[J].福建林业科技,2007,34(3):135-138
[5]赖钟雄,林莉.山茶属植物体细胞胚胎发生研究进展[J].福建农林大学学报(自然科学版),2004,33(4):471-476[6]张志兰.山茶花组织培养过程中的防外植体褐化试验[J].
