摘 要： 以兴安杜鹃为试材, 采用常规观察方法与石蜡切片方法观察种子形态, 通过对光照、温度、赤霉素浓度、NaCl胁迫等条件设置不同处理, 研究了其种子形态与萌发特性, 旨在为兴安杜鹃繁殖培育和苗木生产提供参考依据。结果表明:兴安杜鹃种子成熟时发育至成熟胚阶段, 种子细小, 千粒质量仅为0.100 4 g。兴安杜鹃种子需光萌发;最适其种子萌发的温度为25℃, 过高或过低温度均不利于其种子萌发;一定浓度的赤霉素对其种子萌发有促进作用;NaCl胁迫下兴安杜鹃种子的发芽率、发芽势、发芽指数随盐离子浓度增加呈明显下降趋势, 当NaCl浓度超过0.6%时, 其种子完全不能萌发。因此, 兴安杜鹃种子需光照萌发, 最适其萌发温度为25℃, 对盐胁迫较为敏感, 经600 mg·L-1赤霉素处理的种子萌发效果最佳, 发芽率可达92.67%。
关键词： 兴安杜鹃; 萌发特性; 赤霉素; 氯化钠胁迫;
Abstract： Rhododendron dauricum seeds were used as experimental materials, the seeds morphology was observed for conventional observation method and paraffin section method, and different treatments were set by conditions such as light, temperature, GA3 concentration and NaCl stress.The seeds morphology and germination characteristics were studied, which were intended to provide theoretical basis for seed reproduction and resource protection of Rh.dauricum.The results showed that the seeds of Rh.dauricum were small and the 1 000-seed weight was only 0.100 4 g from maturity to mature embryo.The seeds of Rh.dauricum could not germinate in the dark.The optimum temperaturefor seed germination was 25 ℃, higher or lower temperature than the optimum can reduce the germination rate.A suitable concentration of GA3 could promote the germination.Under NaCl stress, the germination rate, the germination potential and germination index decreased significantly with the increase of NaCl concentration.When NaCl concentration exceeded 0.6%, the seeds could not germinate at all.To sum up, the seeds of Rh.dauricum needed light to germinate, and the optimum germination temperature was 25℃.In addition, the germination were sensitive to the salt stress, and can be promoted by GA3 at 600 mg·L-1, resulting in 92.67% germination rate.
Keyword： Rhododendron dauricum; germination characteristics; GA3; NaCl stress;
兴安杜鹃 (Rhododendron dauricum L.) 属杜鹃花科 (Ericaceae) 杜鹃花属 (Rhododendron L.) 半常绿灌木, 别名达子香、达达香、金达莱、满山红等, 主要分布于黑龙江、吉林、内蒙古等地区[1], 较耐寒, 耐半阴, 喜光, 可生长于干燥瘠薄土或石砾土[2]。兴安杜鹃每年4月下旬冰雪尚未消融时就可开花, 具有极高的观赏价值, 花色艳丽, 花期长, 是北方重要的园林树种之一[3]。研究表明, 兴安杜鹃还具有黄酮类化合物和挥发油成分[4], 叶枝可供药用, 对于止咳化痰、清热燥湿有显着的疗效[5]。
由于近年发生野生兴安杜鹃在网上滥卖事件[6], 甚至是人们常常挖取野生植株用于城市 (小区) 绿化, 导致野生兴安杜鹃资源受到了较大破坏。兴安杜鹃生长周期长, 自然更新较慢, 人工培育难度很高, 在其引种驯化过程中很难实现露地栽培[7]。近年来, 一些学者对兴安杜鹃化学成分、药用价值或扦插繁殖等方面进行了研究, 但关于其种子生物学特性方面的研究较少, 而种子萌发是个体生长发育的关键, 也是种群繁衍的关键[8]。因此, 该研究以兴安杜鹃种子为试验材料, 着重研究光照、温度、不同浓度赤霉素及NaCl胁迫对其种子萌发的影响, 将进一步摸索兴安杜鹃种子萌发的最适条件, 旨在为其引种驯化、苗木繁殖及野生资源保护提供参考依据。
1、 材料与方法
1.1、 试验材料
兴安杜鹃的种子于2018年9月采自哈尔滨市阿城区小岭镇周边山区 (东经127°18′32.9″, 北纬45°16′31.8″, 海拔526 m) 。为避免单株植物对试验结果的影响, 从不同植株上采集成熟的果实, 室温自然干燥后, 种子充分混合用于试验。
1.2、 试验方法
1.2.1、 种子形态观察
根据兴安杜鹃种子细小的特点, 种子大小的测量在LEICA-DM 4000 B LED显微镜下进行。随机挑选相对饱满的种子100粒, 重复3次, 计算平均值和标准差。
采用四分法[8]随机选取相对饱满的兴安杜鹃种子100粒, 去除杂质, 用精确度为万分之一的电子天平称量, 重复8次。最后结果换算成千粒质量, 计算平均值和标准差。采集的成熟种子及时用FAA固定液固定并保存, 利用常规石蜡切片技术进行种子胚切片观察, 酒精系列脱水, 二甲苯透明, 番红染色, 中性树胶封片, 镜检后在LEICA-DM 4000 B LED显微镜下拍照。
1.2.2 、不同温度处理
分别设定6个温度梯度处理, 即10、15、20、25、30、35 ℃。每个温度条件下均取相对饱满种子50粒, 播于带有2层滤纸培养皿内 (Φ=90 mm, 下同) , 加入适量的蒸馏水, 每处理3次重复。每天定时观察、记录并及时补充水分。
1.2.3 、不同光照处理
设定黑暗和光照 (光照12 h/黑暗12 h) 2个处理, 每处理3次重复, 分别选取相对饱满种子50粒置于带2层滤纸的培养皿内, 于25 ℃下萌发。每天定时观察、记录并及时补充水分。
1.2.4、 不同浓度赤霉素处理
设定9个不同浓度赤霉素处理, 即0、100、200、300、400、500、600、800、1 000 mg·L-1。各取一定数量的种子分别用不同浓度赤霉素溶液浸种24 h, 之后用蒸馏水冲洗种子5～8次, 挑选相对饱满的种子50粒, 分别置于带2层滤纸的培养皿内, 25 ℃条件下进行萌发, 每处理3次重复。每天定时观察、记录并及时补充水分。
1.2.5 、NaCl胁迫处理
配置6个NaCl溶液梯度, 即0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。各选取籽粒相对饱满的种子50粒。置于带2层滤纸的培养皿内, 分别加入不同浓度的NaCl溶液, 25 ℃条件下进行萌发, 每处理3次重复。定期观察、记录, 并及时补充相应浓度的NaCl溶液。
1.3、 项目测定
各处理的种子以胚根伸出种子外与种子长轴近等长即视为发芽;种子萌发开始到种子萌发后连续3 d无种子萌发, 即视为发芽结束。根据每天的记录统计种子的发芽率、发芽势、发芽指数和发芽启动时间 (即首个种子发芽时间) 。发芽率 (%) = (已发芽种子数/供试种子总数) ×100;发芽势 (%) = (到达高峰时正常发芽种子粒数/供试种子总数) ×100;发芽指数 (GI) =∑ (Gt/Dt) , Gt为第t天的发芽数;Dt为相应的发芽天数。
1.4、 数据分析
采用Office Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据分析及作图。
2、 结果与分析
2.1、 兴安杜鹃种子形态特征
兴安杜鹃果实为长椭圆形至长卵形, 胎座类型为中轴胎座, 蒴果开裂时种子的发育程度为成熟胚时期 (图1A, B) , 可见胚根已分化, 胚乳丰富 (图1B) 。种子细小, 长椭圆形, 棕褐色, 具条纹, 长为 (1.176±0.170) mm, 宽为 (0.508±0.071) mm, 千粒质量为 (0.100 4±0.001 2) g (表1) , 为细小种子类型。
表1 兴安杜鹃种子大小和千粒质量
2.2、 光照对兴安杜鹃种子萌发的影响
由图2可知, 在黑暗偶见光条件下, 种子一直未见萌发;而光照条件下, 种子在第5～6天开始裂口, 第8天开始发芽启动, 第12天达到发芽最高峰, 此时萌发率达到26.67%。至第17 天基本无新增萌发种子, 从种子萌发开始到发芽结束大约持续10 d, 发芽持续时间较长, 最终发芽率达到76.00%。兴安杜鹃的种子在光照条件下才能萌发, 为典型光敏感型种子。
图1 兴安杜鹃成熟种子纵切片
Fig.1 Embryo section of seeds of Rh.dauricum
注：co，子叶；en，胚乳；hy，胚轴；ra，胚根；se，种子胚。
Note：co，cotyledon；en，endosperm；hy，hypocotyl；ra，radicle；se，seed embryo.
图2 光照对兴安杜鹃种子逐日发芽率的影响
Fig.2 Effects of illumination on seeds daily germination rate of Rh.dauricum
2.3、 温度对兴安杜鹃种子萌发的影响
温度对于兴安杜鹃种子发芽率、发芽势、发芽指数及发芽启动时间均有显着影响, 由表2可知, 10 ℃和35 ℃条件下, 兴安杜鹃种子不能萌发, 说明低温度或过高温度对种子萌发都有一定的限制作用。15 ℃条件下, 兴安杜鹃种子发芽率为15.33%, 发芽势为0%, 发芽指数仅为0.43, 发芽启动时间为15 d, 发芽高峰不明显。20 ℃条件下种子的发芽率、发芽势和发芽指数升高明显, 分别为70.00%、60.00%和2.90, 发芽启动时间为9 d, 第12天达到发芽最高峰。而25 ℃条件下的发芽率、发芽势和发芽指数81.33%、76.67%和3.56, 明显高于其它温度处理, 发芽启动时间为8 d, 第12天达到发芽最高峰。30 ℃条件下的发芽率、发芽势和发芽指数分别为29.33%、19.33%和1.25, 下降较明显, 而发芽启动时间最早为7 d。
表2 不同温度对兴安杜鹃种子萌发的影响
注:不同小写字母间代表差异显着 (P<0.05) , 不同大写字母间代表差异极显着 (P<0.01) , 下同。
2.4、 赤霉素对兴安杜鹃种子萌发的影响
随着赤霉素浓度的增加, 兴安杜鹃种子的发芽率、发芽势、发芽指数逐渐升高 (表3) , 说明一定浓度的赤霉素对其种子萌发有促进作用;而赤霉素浓度超过600 mg·L-1时, 种子萌发率、发芽势及发芽指数明显下降, 说明过高的浓度起不到促进兴安杜鹃种子萌发的作用。100 mg·L-1的赤霉素处理与对照差异不显着, 赤霉素浓度为600 mg·L-1时兴安杜鹃种子的发芽率、发芽势、发芽指数最高, 可达92.67%。
表3 不同浓度赤霉素对种子萌发的影响
2.5、 NaCl胁迫对兴安杜鹃种子萌发的影响
由表4可知, 随盐溶液浓度的增加, 兴安杜鹃种子的发芽率、发芽势及发芽指数呈下降趋势, 即盐迫害程度与NaCl溶液浓度呈正相关。兴安杜鹃种子在浓度为0.1% NaCl条件下的发芽率、发芽势和发芽指数与对照组相比差异显着, 盐胁迫下的发芽启动时间明显迟后, 这说明兴安杜鹃种子在低浓度盐胁迫下虽然可以正常萌发, 但种子活力明显下降。在0.4% NaCl条件下, 发芽率、发芽指数均较低, 发芽势为0%, 发芽启动时间最长为14 d。在0.6% NaCl条件下, 种子无法正常萌发。因此, 兴安杜鹃种子耐盐胁迫能力弱, 高盐溶液会抑制种子的萌发。
表4 NaCl胁迫对兴安杜鹃种子萌发的影响
3、 讨论与结论
兴安杜鹃果实成熟时 (蒴果开裂) 胚发育至成熟胚阶段, 说明其种子不存在形态休眠。其种子细小, 千粒质量仅为 (0.100 4±0.001 2) g, 这与同属的其它种类相似[9,10]。兴安杜鹃种子表面具有条纹状纹饰, 加之种子细小和较高的自然萌发率, 这应该是其易于传播[11]并适应环境条件的一种生存策略。野外环境下, 兴安杜鹃群落植株较为密集, 也进一步验证了这一点。
自然成熟的种子在萌发时, 光照是重要条件之一, 有些种子需要光照才能萌发, 这样的种子为光敏感型种子, 而有些种子在光照条件下则会被抑制萌发或不受光照影响[12,13]。该研究结果表明, 兴安杜鹃的种子在黑暗条件下无法萌发, 光照条件明显可以促进种子的萌发, 由此认为兴安杜鹃的种子为光敏感型。赵红霞等[14]也曾表示蓝荆子 (Rh.mucronulatum Turcz.) 和映山红 (Rh.imsii Planch.) 2种杜鹃的种子在黑暗条件下无法萌发, 这进一步说明光照是杜鹃花种子萌发的必备条件之一。
环境温度可以影响种子萌发时的一系列酶促反应, 同时影响着种子内的新陈代谢与营养物质转化[15]。适宜的温度条件, 可以促进种子吸水, 种皮软化, 同时促进酶促反应, 而温度低时酶的活性变低或无活性, 温度过高时酶会丧失活性, 因此只有在适宜的温度条件下, 才能加快种子的萌发及幼苗生长[16]。该研究结果显示适合兴安杜鹃种子萌发的温度为20～25 ℃, 并以25 ℃条件下的发芽率最高, 可达81.33%。0 ℃和35 ℃条件下, 兴安杜鹃的种子不能萌发, 而在15 ℃和30 ℃条件下, 其种子萌发率较低, 说明过高或过低的温度均不利于其种子萌发, 这与杜鹃属的其它物种萌发特性相似[17,18]。试验结果表明不同处理中的对照组兴安杜鹃萌发率在71.33%～80.67%, 这些都为其自然萌发率, 且试验用的种子是刚刚采收的, 说明兴安杜鹃种子可能存在一定程度的浅休眠。其种子成熟时胚发育至成熟胚阶段, 显然不存在形态休眠, 其潜休眠应该是源自种子内部的抑制物质所致。
赤霉素可以使休眠种子中存在的化学抑制物钝化或失效, 同时具有促进α-淀粉酶的合成或活化的作用, 从而打破种子休眠, 提高种子的萌发率[19], 在杜鹃类种子萌发试验中多有应用, 如雷山杜鹃 (Rh.leishanicum Fang et S.S.Chang) 的最适GA3处理浓度为400 mg·L-1[20];三花杜鹃 (Rh.triflorum Hook.f.) 最适浓度为400 mg·L-1和600 mg·L-1[21];黄杯杜鹃 (Rh.wardii W.W.Smith) 和大萼杜鹃 (Rh.megacalyx Balf.f.et K.Ward) 适宜处理浓度分别为800 mg·L-1和400 mg·L-1[22]。由此说明杜鹃花种子需要较高浓度的GA3溶液处理, 而不同种之间的差异可能与其生长环境或种子储存时间有关[2]。该研究中, 兴安杜鹃种子经低浓度GA3处理后, 对种子发芽率影响不显着, 必须达到较高的浓度才能起到较好的作用, 这可能与其种皮的蜡质影响了赤霉素的渗透率有关[23]。随着GA3浸种浓度的升高, 兴安杜鹃种子发芽率、发芽势及发芽指数先升高后降低, 说明浓度过高会影响种子发芽各项指标。兴安杜鹃种子从浸水开始到种子萌发结束通常持续20 d左右, 萌发持续时间较长。如果用种子育苗, 会导致苗势出现出苗不齐现象。因此, 建议播种前用600 mg·L-1的赤霉素浸种处理, 播种时应不覆土或以一定厚度松针铺盖于地表即可, 以防止阳光直射导致种子 (种苗) 水分流失而枯萎。
种子萌发时对于盐胁迫非常敏感, 植物能否在盐碱环境中生长, 取决于种子是否可以成功萌发[24]。该试验通过综合分析兴安杜鹃种子的发芽率、发芽势、种子活力指数及发芽启动时间来研究其种子的耐盐能力, 试验结果表明兴安杜鹃的种子耐盐胁迫能力弱, 在低浓度NaCl条件下, 兴安杜鹃种子可正常萌发, 萌发率受影响不大, 但NaCl浓度超过0.1%时, 种子发芽率、发芽势及种子活力指数开始急剧下降, 浓度达到0.6%时, 兴安杜鹃种子无法正常萌发, 说明高盐溶液会抑制其种子萌发, 兴安杜鹃在栽培时应注意土壤盐碱程度。盐胁迫对植物萌发的影响十分复杂, 盐分虽然是土壤的组成成分之一, 也是植物生长的必须元素, 但过度的盐胁迫会抑制种子的萌发甚至迫害植物的生长[24]。已有的研究数据显示低浓度盐胁迫环境可促进植物种子的萌发[24,25], 李志良等[26]对繁花杜鹃 (Rh.floribundum Franch.) 种子盐胁迫研究也证实这一点。吴月燕等[27]表示皋月杜鹃 (Rh.indicum (L.) Sweet) 在低浓度NaCl条件下可正常生长, 且其生理指标有所提高, 但随着盐胁迫的逐渐加重植株生长受到显着的阻碍甚至致死。该研究结果显示, 兴安杜鹃在低浓度盐胁迫条件下发芽指标均低于对照组, 尤其是发芽势明显偏低, 在一定程度上证明低浓度盐胁迫对兴安杜鹃种子萌发无促进作用。此前, 张利霞等[24]研究发现复合盐危害小于单盐危害, 但该研究中盐溶液种类选择单一, 无法对兴安杜鹃种子在复合盐环境下的萌发状态进行研究。因此, 复合盐对于兴安杜鹃种子的影响还需要大量试验来证明。
综上, 兴安杜鹃种子成熟时发育至成熟胚阶段, 种子细小, 千粒质量仅为0.100 4 g。不同光照条件、温度、赤霉素浓度以及NaCl浓度对于兴安杜鹃种子萌发具有不同的影响。兴安杜鹃种子萌发需光照条件, 适宜萌发温度为25 ℃, 对盐胁迫较为敏感, NaCl浓度高于0.6%时, 种子无法正常萌发, 种子萌发适宜的赤霉素浓度为600 mg·L-1。
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