2.2.3 纯化前后 DNA 四面体及三角双锥的表征
收集到的产物浓度较低, 且流动相中含有高盐,为了方便下游应用, 我们使用 MWCO 30 kDa 的超滤管进行超滤, 对其进行浓缩并将 DNA 四面体置换到TM 缓冲液中. 为了尽可能减小超滤对样品的损伤,超滤中使用的离心力不要超过 2000 g. AEC 纯化前后的DNA四面体使用8% PAGE进行表征, 电泳在冰浴条件下进行, 电压 80 V, 电泳时间 2~3 h, 电泳结束后使用GelRed染色15~30 min, 用化学发光成像系统对其成像.
2.2.4 哑铃状 DNA 纳米结构的制备与表征
设计两个互补的 TH20: A20-TH20 和 T20-TH20,分别经 AEC 纯化, 方法用 AEC-2 程序. 定量后以 1:1等摩尔混匀, 37℃孵育 2 h 杂交, 对比实验中使用未纯化的 A20-TH20 与 T20-TH20 以相同条件杂交. 杂交后的结构使用含 1×GelRed DNA 染料的 1%琼脂糖凝胶电泳进行表征, 电泳条件为冰浴, 80 V, 3 h, 电泳完毕后进行成像.
3 结果与讨论
3.1 AEC 纯化方法的建立及产物的表征-TH20
以 TH20 为例, 确定 AEC 分离纯化的条件, 并对得到的多个产物进行成分鉴定. 一步退火合成的TH20, 电泳表征如图 1(B)中泳道 1 所示, 多条条带的存在证明其中除了有目标产物外, 还有多个副产物存在. 使用 Image J 软件计算电泳条带灰度值可以得出 TH20 的产率在 42% (条带 1 最前端). 另外还有超过一半的错误折叠结构, 大部分错误折叠的结构由于分子量太大而被堵在凝胶的上样孔, 无法被电泳出来, 这里我们命名为高聚物; 也有少部分结构能从上样孔泳出但距离较短, 分子量仍然比 TH20 大, 命名为低聚物.
本实验中我们选用的阴离子交换色谱柱, 其填充物是溶剂兼容性良好的直径13 μm无孔基底, 在其表面覆盖有一薄层季铵(阳离子)修饰的直径 100 nm的树脂, 使其含有丰富的阴离子交换位点. AEC 纯化DNA 四面体主要是依据混合物中不同组分跟带正电的固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离.
DNA 分子量越大, 所携带的阴离子越多, DNA 四面体的合成产物中所携带的阴离子数目依次为 TH20<低聚物<高聚物, 则它们与带正电的固定相之间的结合强弱依次为 TH20<低聚物<高聚物. 首先在色谱柱中通以低离子强度流动相以促使样品组分结合到固定相上, 慢慢增加流动相的离子强度, 混合物组分中与固定相结合较弱的单体组分会先被流动相中的阴离子交换下来, 而结合较强的错配结构需要更高的盐浓度才可被置换下来, 所以在 AEC分离 DNA四面体的过程中依次被洗脱出来的是 TH20、低聚物、高聚物. 图 1(A)为使用 AEC-1 梯度方法纯化 TH20 的图 1 AEC 分离 TH20 的色谱图及各组分的 PAGE 表征. (A)AEC-1 方法分离 TH20 的色谱图; (B) PAGE 分析鉴定各色谱峰, 其中, M: 20 bp DNA Ladder; 条带 1: 未纯化的 TH20;条带2: TH20单体, 对应于(A)中的色谱峰a; 条带3: 低聚物及部分高聚物, 对应于(A)中的色谱峰b和c; 条带4: 高聚物,对应于(A)中的色谱峰 d色谱图, 当 NaClO4的浓度从 0.1125 mol/L 增加到0.1875 mol/L 时, 会依次洗脱出 a、b、c 三个主要的色谱峰, 然后继续增加盐浓度至 0.2625 mol/L, 在这种情况下结合到柱填料上的样品组分迅速被洗脱下来, 为峰 d. 将这些峰组分收集后进行电泳表征, 从图 1(B)可以看出, 峰 a 为正确组装的 TH20, 峰 b 和 c的混合物包含低聚物, 而峰 d 对应高聚物.
3.2 利用 AEC 纯化其他 DNA 纳米结构
其他 DNA 纳米结构如 TH13、TH17、TH26、TH30和 TB20, 其 PAGE 结果表明, 尽管它们的产率各不相同, 但仍存在较大的聚集结构(图 2(B), 条带 1 为纯化之前的产物). 采用AEC-2程序对以上多个DNA四面体进行分离, 色谱图如图2(A)所示. DNA三角双锥由于结构较大, 带有的阴离子偏多, 在纯化时需要在更高的离子强度下才能出峰, 采用 AEC-3 程序进行分离. 使用 PAGE 表征将各个 DNA 纳米结构纯化前后的效果进行对比, 如图 2(B)中条带 2 所示, AEC 纯化后的各结构的纯度大大提高, 大部分副产物被有效去除. 目标产物的产率从纯化前的 30%~65%到纯化后的 90%~98%, 证明 AEC 在 DNA 四面体等纳米结构的纯化方面具有非常高的效率和普适性.
3.3 哑铃状 DNA 纳米结构的制备与表征
我们利用 AEC 纯化后的 DNA 四面体构建了哑铃状的 DNA 纳米结构, 并对其产率和纯度进行了考察. 首先设计合成了两种带手臂链的 TH20 四面体:
一种在四面体的顶点伸出 20 个 A, 命名为 A20-TH20;另一种是伸出 20 个 T, 以 T20-TH20 命名. 各自退火后形成四面体, 如图 3(b)条带 1 和 2 所示. 由于分别引入手臂链 A20和 T20, 使得 DNA 四面体的产率进一步降低, 条带 1 和 2 中有大量的弥散性杂带出现. 直接用 A20-TH20 和 T20-TH20 来制备哑铃状结构, 得到的产物也有着非常弥散的条带, 产率在 11%左右. 分别将 A20-TH20 和 T20-TH20 两种四面体用 AEC 进行分离纯化, 色谱图如图 3(a)所示. 我们将纯化后收集到的 A20-TH20、T20-TH20 两种四面体进行杂交来构建哑铃状 DNA 纳米结构。图 3(b)中的琼脂糖凝胶电泳结果显示, 经过纯化后的四面体的纯度很高, 在95%左右, 其杂交后的产物纯度也有大幅提升, 大于90%. 该数据证实在 DNA 纳米结构的制备问题上,前期对四面体的纯化非常重要, 较纯的 DNA 四面体可以大大提高后期自组装结构的产率.
4 结论
我们将 AEC 方法用于 DNA 四面体及三角双锥的纯化, 将这些 DNA 纳米结构从初始合成纯度30%~65%提高到 95%左右, 并且我们证明经过 AEC纯化后的 DNA 四面体更有利于制备产率更高的DNA 四面体哑铃状结构. 与电泳割胶回收相比, 该方法对结构无破坏、操作简单、回收率高、短时间内即可纯化出大量样品. 该方法可以广泛用于 DNA 纳米结构的分离纯化, 分离过程中所使用的色谱柱、流动相等条件可以根据待分离材料的尺寸、维度等来选择. 由于离子交换所用的网孔状介质具有分子筛和离子交换双重功效, 对于尺寸较大的 DNA 三维折纸,可以根据需要选择合适粒径的填料即可. 该方法解决了大规模、高纯度 DNA 四面体的制备难题, 对于DNA 纳米结构未来作为载体或者免疫佐剂等在生物学和医学领域广泛应用有着重要意义.
