很多蛋白质或多肽在一定条件下可以形成淀粉样纤维，至少20 多种人类疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏病、家族性淀粉样神经病变以及Ⅱ型糖尿病等与此类淀粉样纤维沉积有关[1~4]. 胰岛素是一种由 51 个氨基酸残基组成的多肽，极易形成淀粉样纤维，通常将其作为研究多肽淀粉样纤维化、筛选抗纤维化药物以及纤维细胞毒性分子机制的模型分子[5]. 虽然目前尚无证据表明任何疾病与胰岛素纤维化有关，但在临床应用中，胰岛素在生产、储存过程中以及在注射部位形成的纤维可能对病人产生免疫原性[6].
为抑制蛋白质淀粉样纤维化，溶解或者破坏淀粉样纤维结构被认为是治疗相关疾病的有效途径。多酚化合物，特别是一些天然多酚类物质可以抑制蛋白质的纤维化[7~9],并能够破坏成熟的纤维结构，将其转变为无定形聚集体，降低纤维的细胞毒性作用[10]. 这些多酚的抗多肽纤维化作用被认为既与其多环和多羟基结构有关，也可能与其抗氧化作用或促氧化作用有关[11,12],但具体作用机制尚无定论。
本文采用牛胰岛素作为模型分子，探索了几种结构相近的简单多酚化合物对多肽淀粉样纤维化的抑制作用，以期从这些化合物的构效关系来揭示多酚类化合物抗多肽淀粉样纤维化的分子机制。
1 试验部分
1.1 试剂与仪器
牛胰岛素（ 分子量 5733） 、硫黄素（ ThT） 、氯化硝基四氮唑蓝（ Nitroblue NBT） 、酚化合物及对苯醌购自 Sigma-Aldrich 公司； 电泳相关试剂购自 Bio-Rad 公司； 其它试剂均为国产分析纯。LS-55 型荧光分光光度计 （ 美国 Perkin-Elmer 公司） ; JEM-1400 型透射电子显微镜 （ 日本 JEOL公司） .
1.2 实验过程
1.2.1 胰岛素淀粉样纤维的制备 用 20 mmol / L 盐酸溶液（ pH = 1. 7） 配制 100 μmol / L 牛胰岛素水溶液，加入不同浓度的酚化合物，于 50 ℃水浴中孵育 5 d,按一定的时间间隔取样并在 4 ℃保存备用。
1.2.2 ThT 荧光检测 用 10 mmol / L 磷酸盐缓冲液（ pH = 7. 0） 配制 1 mmol / L ThT 溶液，于 4 ℃ 避光保存备用。 取 10 μL 孵育的胰岛素样品，加至 10 mmol/L Tris-HCl 溶液（ pH=8. 0） 中，再加入 30 μL ThT溶液使其终浓度为 10 μmol/L,振荡 10 s 左右，用荧光分光光度计记录荧光强度（ 激发波长为 440 nm,发射波长为 484 nm） .
1.2.3 透射电子显微镜（ TEM） 观察聚集体形态 将制备的胰岛素纤维或者聚集体用二次蒸馏水稀释 5倍，取15 μL滴于镀膜铜网上，静置 10 min 后用滤纸沿边缘吸干，滴加 15 μL 醋酸铀（ 质量分数为 2%）染色 10 min. 用透射电子显微镜观察纤维形态并拍照（ 电压 80 kV） .
1.2.4 SDS-凝胶电泳及电转分析 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE） 采用分离胶（ 质量分数为15%） 在 Tricine 缓冲体系（ pH = 8. 2） 中进行，胰岛素加样量为 10 μg,用考马斯亮蓝染色。 采用 GEHealthcare 电转盒将凝胶上的条带转至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上，在碱性（ pH = 10） 条件下由 NBT 染色。
2 结果与讨论
实验条件下，胰岛素可在约 4~5 d 形成成熟的淀粉样纤维，纤维的生长过程采用 ThT 荧光法监测。ThT 是一种能够与淀粉样纤维的 β 片层结构特异性结合的荧光探针，当与淀粉样纤维结合时，其在440 nm 波长光激发下产生 484 nm 的特征荧光发射峰。 与大多数蛋白质纤维化过程相似，胰岛素的纤维生长过程也具有成核-聚合的动力学特征[13],即纤维化主要包括成核、生长和成熟 3 个阶段，ThT 荧光曲线表现为 S 型特征[见图 1（ A） ].
由图 1（ A） 可见，各种酚化合物对胰岛素的淀粉样纤维化作用不同。 200 μmol/L 的苯酚和间苯二酚对胰岛素纤维化有一定的促进作用，相应的 ThT 荧光在 1. 5 d 后开始增强，表明其具有较短的成核期； 与之相比，相同浓度的邻苯二酚和对苯二酚则对胰岛素纤维化表现出明显的抑制作用，相应的ThT 荧光在孵育 3 d 后开始略有上升，第 5 d 的荧光强度仅为胰岛素对照样品的 27%和 19%. 由于邻苯二酚和对苯二酚的纤维化抑制作用可能与其氧化产物醌中间体相关，故采用对苯醌同时进行对照分析。 如图 1（ A） 所示，在 200 μmol/L 对苯醌存在下，胰岛素纤维化几乎被完全抑制，整个孵育过程中ThT 荧光强度无明显增加。
邻苯二酚、对苯二酚和对苯醌对胰岛素淀粉样纤维化的抑制作用与浓度呈正相关。 对苯二酚的浓度效应如图 1（ B） 所示，可见较低浓度的对苯二酚可延缓胰岛素的纤维化，包括增加延迟期时间和降低纤维的生长速度。 邻苯二酚和对苯醌的浓度效应与此相似，但对苯醌的抑制作用比 2 种苯酚强，100μmol/L 对苯醌即可完全抑制胰岛素纤维的生长[图 1（ C） ].
酚类化合物对胰岛素淀粉样纤维化的作用可进一步由 TEM 表征结果（ 图 2） 证实。 作为对照的成熟胰岛素纤维的直径为 5~35 nm,长度分布为 600~3000 nm[图 2（ A） ],能与刚果红结合并在偏振光下显现出特征的黄绿色，具有淀粉样聚集体的特性。 当胰岛素与 200 μmol/L 的苯酚[图 2（ B） ]或间二苯酚[图 2（ C） ]共孵育 5 d 后，纤维密度比对照样品有所增加，与 ThT 荧光结果一致； 而相同浓度的邻苯二酚[图 2（ D） ]和对苯二酚[图 2（ E） ]则明显抑制纤维的生成，只能观察到少量的细短纤维； 100μmol/L 对苯醌即可完全抑制纤维的生成，故仅能观察到一些小的无定形聚集体[图 2（ F） ].
研究表明，天然多酚化合物的抗多肽纤维化作用与其氧化还原性质有关[9,10],Hirohata 等[14]也报道天然多酚的氧化产物通常具有更强的抑制纤维化作用。 在本文选用的 4 种酚化合物中，邻苯二酚和对苯二酚可抑制胰岛素纤维化，而苯酚和间苯二酚则无此作用，这可能与前 2 种化合物具有更低的氧化还原电位，并且在氧化过程中易于形成醌类产物有关。 多酚经氧化后的醌类产物具有较高的反应活性，可修饰多肽链中的一些残基，如氨基、巯基和一些杂环残基等[15,16]. 电转-NBT 染色实验是一种特异性检测醌修饰多肽的方法[17]. 凝胶电泳分离的多肽经电转移至 PVDF 膜上，在碱性条件下，NBT 与醌修饰多肽反应转变为蓝色不溶物。 该反应具有较高的特异性和灵敏度，常用于生物样品中醌修饰多肽的分析鉴定。
图 3 示出了在酚化合物和苯醌存在下，孵育 5 d 的胰岛素聚集体的 SDS 电泳[图 3（ A） ]和相应的电转-NBT 检测结果[图 3（ B） ]. 图 3（ A） 泳道 1 和 2 分别是未经孵育的胰岛素单体和孵育 5 d 的胰岛素成熟纤维，可见在 SDS 的作用下，纤维被解聚为胰岛素单体，不同的是，在泳道 2 胰岛素单体上方可观察到少量呈拖尾状的聚集体； 苯酚（ 泳道 3） 和间苯二酚（ 泳道 5） 可促进这种 SDS 不溶聚集体的形成。
该多聚体的形成是否与淀粉样纤维化有关，目前尚不清楚。 与之相比，加入邻苯二酚（ 泳道 4） 、对苯二酚（ 泳道 6） 和苯醌（ 泳道 7） 的样品除了少量二聚体外，在考马斯亮蓝染色条件下观察不到拖尾状的多聚体。
NBT 检测结果表明，与邻苯二酚、对苯二酚和苯醌共孵育 5 d 的胰岛素可与 NBT 反应生成紫红色产物，表明胰岛素分子被醌所修饰； 而与苯酚和间苯二酚共孵育的胰岛素则无此特征的紫红色。 结合ThT 荧光和 TEM 结果可以推断，邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用与其转变为醌中间体，进而与多肽链结合有关。 在 SDS 电泳和充分透析的条件下，醌仍然能够与胰岛素分子紧密结合，这种结合是否与共价作用有关，尚需进一步实验证实。
为了进一步证实上述结论，在制备胰岛素聚集体之前，在样品中充分通入氮气，以除去溶液中的氧，然后在密闭条件下，按照前述条件孵育 5 d. ThT 荧光结果[图 4（ A） ]显示，在无氧条件下，邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用显着降低，表现为最终孵育产物具有较强的 ThT 荧光； 而苯酚和间苯二酚与有氧条件下相同，对胰岛素纤维化无抑制作用。 TEM 表征结果表明，在无氧条件下，与 200 μmol/L 邻苯二酚[图 4（ B） ]和对苯二酚[图 4（ C） ]共孵育 5 d 的胰岛素具有通常情况下的纤维形态和密度，即邻苯二酚和对苯二酚在此条件下无抑制胰岛素纤维化的作用，这与 ThT 荧光结果相符。
另外，对上述孵育 5 d 的样品进行电转-NBT 检测发现，在无氧条件下加入所有酚化合物的样品均不能被 NBT 染色（ 数据未给出） ,即未生成醌修饰胰岛素。 上述结果充分说明，酚化合物经氧化形成醌中间体并对多肽链修饰是其抗多肽纤维化的主要途径。
表没食子儿茶素没食子酸酯（ Epigallocatechin gallate,EGCG） 为绿茶的主要成分，是最有希望成为多肽纤维化相关疾病治疗药物的天然多酚化合物。 在抑制 β-淀粉样肽及突触核蛋白等纤维化过程的研究中，可观察到 EGCG 形成醌中间体并对多肽修饰后的产物[18~20]. 但这种修饰在纤维化抑制过程中是否具有重要作用，仍然难以确定。 目前，对天然多酚的抗多肽纤维化的分子机制多采用完整的多酚分子与多肽链的作用模型[18]. 事实上，无论是在体实验还是体外实验，多酚化合物在介质中的稳定性十分有限，充分考虑其氧化产物醌中间体的作用是十分必要的。
3 结 论
研究了几种具有单环结构的简单酚化合物对胰岛素纤维化的抑制作用，结果表明，能够形成醌中间体的邻苯二酚和对苯二酚具有抑制胰岛素纤维化的作用，这种作用与对苯醌的作用相似； 而苯酚和间苯二酚在实验条件下不能与胰岛素形成醌修饰产物，也不具有抑制纤维化的作用。 在无氧条件下，邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用明显降低，说明酚化合物经氧化形成的醌中间体是其抗胰岛素纤维化的主要活性结构。 这些醌中间体通过修饰多肽链改变了多肽链间的作用力，进而影响甚至阻断胰岛素分子自组装为淀粉样纤维。
