HCV 是在输血后导致肝炎发生的一个重要因素 , 往往经血液或血液制品进行传播 , 经调查发现 , HCV 感染具有世界性分布特点 , 为了能够避免 HCV 通过血液进行扩散 , 需对每个献血者实施抗 -HCV 指标检测[1].通常选取间接酶联免疫法进行检测 , 此方法操作时包被抗原的组成及质量具有关键作用[2].目前对抗 -HCV 间接酶联免疫法试剂进行单独检测时显现阳性 , 且处于临界值相邻样本 , 以双抗原夹心酶联免疫法试剂进行检测时则呈现阴性 , 伴随临床医学发展 ,双抗原夹心酶联免疫吸附实验 （ELISA） 对于 HCV 血清学诊断具有较为显着的改善作用 , 效果明显[3].本文选取 190 份血液筛查阴性标本 , 分析双抗原夹心法作用 , 现报告如下。
1材料与方法
1. 1试验材料 选取本院 2012 年 6 月 ~2014 年 12 月 190份血液筛查阴性标本 , 同时采集 190 份质控血液标本。
1. 2方法 将所选取的 380 份血液标本进行严格检测 , 应用双抗原夹心法检测 HCV 抗体。在检测时所应用试剂有吉比爱、Ortho 丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂 , ChironRIBA确认试剂。
1. 2. 1抗原制备 嵌合表位抗原经包涵体的形式表达 , 采取离子交换层析措施进行纯化 , 然后通过 SephadexG-50 柱凝胶完成过滤采集 , 应用 SDS-PAGE 将抗原蛋白进行仔细鉴定。
1. 2. 2双抗原夹心法 应用 50 mmol/L 碳酸盐缓冲液对抗原予以稀释处理 , 多肽抗原具体浓度为 :结构处多肽 151 g/ml,NS4 处多肽 0.51 g/ml, NS5 处多肽 0.251 g/ml, 所应用到的基因工程表达抗原具体浓度有 c7 应用 1 g/ml, C11 应用 1 g/ml.
每个孔内均加进 100 μl, 在 37℃状态中持续保存 1 h, 然后放置到 4℃冰箱内过夜 , 应用 30% 小牛血清 PBST 实施封闭处理 , 在每个孔内加进 200 μl, 37℃状态中保存 1 h, 然后去除封闭液 , 应用 50 μl 样品稀释液 , 每个孔内加进 5 μl, 37℃状态中保存 30 min, 然后应用 PBST 进行 5 次冲洗。选择最为适宜酶稀释度 , 通过棋盘滴定方法在每个孔内加进 50 工作浓度的酶标记抗原 , 37℃条件下放置 15 min, 经 PBST 冲洗 5 次 ,每孔加入 50 μl 底物缓冲液及 50 μl 显色剂 , 在 37℃状态中保存 10 min, 使之能够完全显色。然后在每个孔内加进 50 μl2 mol/L 硫酸 , 停止反应 , 应用酶标仪于 450 nm 波长条件下实施吸光度效果检测 , 若检测结果≥临界值者则表示阳性 ,反之则表示阴性。
2结果
应用双抗原夹心法检测标本 , 显示 126 份为阳性标本 , 1份为阴性标本 , 应用 ChironRIBA 确认试剂检测显示其均呈现阳性 , 双抗原夹心法检测敏感性为 99.21%.见表 1.
3讨论
对患者 HCV 抗体进行检测是确定其是否发生感染的初步阶段 , 主要有用作筛检工作的酶免疫检测 （EIA） 以及用作确证工作的重组免疫印迹试验 （RIBA）， 其中 RIBA 由于需要较高费用且并未建立严格试验标准 , 目前在临床诊疗中并无较多应用[4].由于 EIA 存在较为明显的便利性及稳定性、自动化功能强、价格较低等优点 , 在临床中应用到血液筛查及检测工作较为广泛。目前 EIA 发展至第三代 , 依然实施间接法予以检测 , 因其方法学存在一定固有缺陷性 , 极易导致结果出现假阳性及漏检情况[5].目前在临床中将双抗原夹心ELISA 法检测试剂作为发展方向具有较为明显应用价值 , 夹心法可使得酶标记的特异性抗原将间接法检测时酶标记的抗体进行取代由此完成整个检测 , 与间接 ELISA 法进行比较 ,其对于样品检测存在双特异性选择特点 , 可以将血清内出现的抗 HCV 的总抗体完成检测 , 有效防止间接 ELISA 法所存在的检测弊端 , 确保检测结果具有更高的敏感性与特异性 ,而且因为 HCV 抗原所具有的分子量较小 , 以酶进行 HCV 抗原的直接性标记 , 往往使得空间位阻情况发生 , 导致抗体与抗原无法轻易结合 , 存在较为明显抑制作用 , 因此 HCV 抗原的标记是建立抗 HCV 抗体的双抗原夹心 ELISA 检测方法的一个较为重要的难点[6].
在本文研究中 , 双抗原夹心法检测显示阳性为 126 份 ,阴性为 1 份 , 双抗原夹心法检测无需对血清产品予以稀释 ,也不会因类风湿因子等不良因素而受到干扰 , 存在较为理想的特异性 , 而且能够对血清中各种抗体予以检测 , 尤其免疫球蛋白 M（IgM） 类抗体可以明显减少自病毒感染至应用 ELISA法检测到抗体间的“窗口期”.所以采取双抗原夹心 ELISA法检测确保 HCV 感染诊断试剂存在较高特异性 , 其检出率明显上升 , 有效缩短检测时间 , 具有较高临床推广应用价值。
参 考 文 献
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[6] 赵璐 , 冯悦 , 夏雪山 . HCV 基因型的差异性流行与进化 . 遗传 ,2012, 34（6）：666-672.
