2 高产 AmpC 酶或 ESBLs 合并外膜蛋白缺失
肺炎克雷伯菌在其的外膜主要表达2种膜孔蛋白（OmpK35和OmpK36），碳青霉烯类及其他亲水分子等通过外膜蛋白进入周质间隙后与相应结合蛋白结合而发挥抗菌作用。当外膜蛋白缺失时，抗菌药物由于失去必要的通道不能进入菌体，而产生耐药[7].临床与实验研究表明，产ESBLs的克雷伯菌膜孔蛋白缺失将会导致对头孢西丁及单环β-内酰胺类的耐药，并对喹诺酮类的敏感性降低。另外，在产CTX-M型β-内酰胺酶或AmpC β-内酰胺酶菌株中，膜孔蛋白缺失将会导致对碳青霉烯类敏感性降低[14].
单独的OmpK36或OmpK35孔蛋白缺失将会导致肺炎克雷伯菌对头孢唑林、头孢噻吩以及头孢西丁等抗生素耐药，但对碳青霉烯类仍然敏感[15].如果两种膜孔蛋白同时缺失合并ESBL或AmpC酶将会使肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素显着耐药[16].研究发现，在DHA-1-ST11和CMY-2-ST45合并Ompk35膜孔蛋白缺失的菌株中，部分是由于在先前使用抗菌药物过程中导致Ompk36缺失[16].因此，认为抗生素的压力在细菌耐药性突变过程中起着重要的作用。临床研究也发现，对碳青霉烯类药物敏感缺乏OmpK35的产CTX-M-15克雷伯菌在美洛培南治疗5 d后通过减少OmpK36以及上调外排而产生高度耐药[17].DHA-1型β-内酰胺酶合并外膜孔蛋白OmpK36的缺失可能是肺炎克雷白菌株对头孢西丁和碳青霉烯产生耐药的主要原因[18].
3 肺炎克雷伯菌外排泵系统
肺炎克雷伯菌中最重要的多药外排系统是AcrAB-TolC外排泵，该泵由外膜通道TolC,位于内膜的继发性主动转运体，AcrB和周质蛋白、AcrA三者构成完整的膜蛋白。这个主动转运系统可以有方向性地运输不同的化合物，使得克雷伯菌对多种抗生素产生耐药。根据对AcrAB-TolC多药外排泵基因及结构的研究，通过它，细菌可将药物从菌体排出，从而使抗生素由于浓度过低而不足以发挥杀菌或抑菌作用[19].AcrAB-TolC外排泵属于耐药结节化细胞分化（RND）家族，通过消耗质子动力而实现外排[20].研究报道，当移除包括克雷伯菌、沙门菌、奈瑟菌等外排泵后，不仅对细菌耐药性，而且对适应性以及毒力都有重要影响[21].我国浙江大学的研究发现，外排泵在对药敏感及耐药菌株中都广泛分布，环丙沙星诱导会增强肺炎克雷伯菌外排泵活性[22].AcrAB外排泵是肺炎克雷伯菌多重耐药的重要机制之一，环丙沙星在充当AcrAB外排泵的底物，并最终降低细胞内抗生素浓度[23].有研究用C14标记的环丙沙星诱导肺炎克雷伯菌，26个菌株中有24个（92%）表现为外排泵高活性，定量分析发现，外排泵高活性菌株中能排出90%的抗生素[24].还有研究报道，肺炎克雷伯杆菌外排泵不仅可表现对喹诺酮类药物的高度耐药，而且对碳青霉烯类药物的敏感性也会下降，同时发现肺炎克雷伯菌AcrAB外排系统对宿主抗菌药物多肽的耐药作用[25].如果外排泵对碳青霉烯类药物外排增多，则导致菌内药物浓度降低，从而产生耐药性，但当膜对碳青霉烯类药物通透性较好时，药物的主动外排速度不及药物内流，导致菌体对该药物仍敏感。
4 生物膜形成
研究表明，生物膜的形成是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的主要机制之一，肺炎克雷伯菌形成的生物膜仅对氨苄西林与环丙沙星通透性较好[26],而对碳青霉烯类药物通透性较差。多种具有本质差别的特异性生物膜机制以一种可逆并短暂的方式共同作用导致了生物膜对抗生素的高水平的耐药，肺炎克雷伯菌生物膜对碳青霉烯类抗生素耐药机制可能有以下6点：①阻止抗生素扩散进入生物膜。生物膜多聚糖基质能充当阻止抗生素扩散进入生物膜的角色，因为抗生素既可以与生物膜基质发生化学反应也可以依附于阴离子多糖上。抗生素进入生物膜的时间超过其治疗时间，使得进入菌体的抗生素低于其致死剂量的抗生素，更易诱导细菌产生耐药。②滞留菌。生物膜包含一种可以长期以缓慢或静止生长状态存在的可逆性亚群，让细菌对外界压力有更强的耐受性。相对于快速生长的细胞，抗生素对以缓慢或静止生长状态的细胞不敏感。因此，细菌生物膜的缓慢生长使得它们对抗生素敏感性降低。③营养限制诱导的压力反应。实验室中，细菌由于外界环境中营养的限制变得对抗生素高度耐药。由于外周细胞营养消耗以及减少氧气和营养物质的扩散通过生物膜，营养限制同样可发现在生物膜中。
营养限制诱导的压力反应常导致细菌生长和分裂受到抑制，使细菌长期处于静止状态，而碳青霉烯类药物由于以杀伤分裂状态的细菌为主，其作用难以有效发挥。④细胞外基质。生物膜中的细胞被包含在一个由细胞外DNA（eDNA）和蛋白质组成的一个多糖基质中，除了提供稳定的结构外，这个多糖基质有大量充满水分的空间和通道，保护细胞免于抗生素破坏。另一方面，这个多糖基质能促进如碳青霉烯酶等抗生素降解酶的积累，可有效阻止抗生素进入菌体内部[27].⑤密度信号感应系统。目前研究表明，该系统对细菌耐药性的调控机制主要表现在两方面，一是通过调控生物膜的形成，提高菌群耐药性；二是直接参与多重耐药外排泵的调控，提高细菌耐药性[28].⑥药物流出泵。流出泵允许细菌通过消除有毒物质调节其内部环境，包括抗菌药物、代谢产物以及密度信号感应分子[26].普遍认为，多重耐药泵YhaQ参与细菌生物膜的耐药过程，RapA调节蛋白能够增长多重耐药基因yhcQ的转录而导致耐药。尽管对于肺炎克雷伯菌生物膜对碳青霉烯类的耐药机制已经有上述许多解释，但因生物被膜的组成、形成机制不同，其耐药机制目前还有许多未知的地方[26],故肺炎克雷伯菌的生物被膜耐碳青霉烯类抗菌药的机制仍有待进一步研究，临床上生物膜的形成对于肺炎克雷伯菌感染的治疗与院内感染控制方面仍然是一个巨大的挑战。
由于抗菌药物研发相对于细菌耐药性进展的相对滞后，及临床上存在的不合理用药，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药甚至是多重药物耐药性已越来越受到包括医学界以及全社会关注的问题。肺炎克雷伯菌因其本身基因结构，决定了碳青霉烯类抗生素作为对抗这类细菌引起的严重感染的最后一道防线。因此，在正确认识耐碳青霉烯类抗生素的菌株，深入研究其耐药机制，加大对新型药物的研发力度，规范使用碳青霉烯类抗生素的前提下，有必要建立全方位的感染控制干预机制，开展一系列的感染控制措施。例如，采取严格的入院监测标准以及严格的接触隔离预防性措施；同时在高危病房建立积极有效的监控机制，为碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌感染阳性患者提供单独隔离；采取有效的手卫生措施也必不可少。
参考文献：
[1] Broberg CA,Palacios M,Miller VL. Klebsiella:a longway to go towards understanding this enigmatic jet-setter[J]. F1000Prime Reports,2014,6:64.
[2] Ma L, Siu LK, Lin JC, et al. Updated molecularepidemiology of carbapenem-non- susceptible Escherichiacoli in Taiwan:first identification of KPC-2 or NDM-1-producing E. coli in Taiwan [J]. BMC Infect Dis,2013,13:599.
