2 结果
2. 1 金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测结果 155 株菌株中，4 种肠毒素基因总检出率为29.03%（ 45/155） ,其中 sea 阳性株为 26 株（ 16. 77%） ,seb 阳性株为 9株（ 5. 81%） ,sec 阳性株为 18 株（ 11. 61%） ,sed 阳性株为 6 株（ 3. 87%） .45 株菌株最多能同时检测出2 种肠毒素，共出现8 种肠毒素基因组合，sea（ 14株） 、sec（ 9 株） 和 sea + sec（ 8 株） 3 种基因组合居于前 3 位。见表 2.
2. 2 肠毒素基因阳性金黄色葡萄球菌 MLST 分型结果分析 45 株肠毒素基因阳性菌株可分为 15个 ST.ST1 的菌株有 14 株，占 31. 11% ; ST5 的菌株有 6 株，占 13. 33% ; ST1121 和 ST15 的菌株均为 4 株，各占 8. 89% ; ST188 和 ST239 各 3 株，各占 6. 67% ; ST6 和 ST59 各 2 株，各占 4. 44% ; 其他ST 均只有 1 株菌株。从金黄色葡萄球菌 MLST 标准数据库中选择分离自中国患者和携带者的菌株作为参照，利用 eBURST V3 软件绘制菌株 ST 分布图。数据库中参考菌株共有 156 株，分为 137 个ST.ST239 的菌株有 13 株，占 8. 33% ; ST88 菌株有 3 株，占 1. 92% ; ST5、ST241、ST865、ST1277 和ST2184 各 2 株，其他均只有 1 株。参考菌株分离时间为1998、2001 2002 和2004 2012 年，主要来自北京市（ 27 株） 、香港（ 19 株） 、四川省（ 15株） 、江西省（ 14 株） 、安徽省（ 14 株） 和浙江省（ 14株） .201 株中国临床株可分为 11 个克隆群。最大克隆群为 ST1 克隆复合体，由 45 株菌株组成（ 22 株宁波株和 23 株中国其他地区株） ,存在 1 个一级亚群（ ST188） 和 1 个二级亚群（ ST2201） .第二大克隆群为 ST239 克隆复合体，由 35 株菌株组成（ 4 株宁波株和 31 株中国其他地区株） ,并且是主要起源克隆群（ SLV = 15） .第三克隆群为 ST5克隆群，由 22 株菌株组成（ 7 株宁波株和 15 株中国其他地区株） .宁波肠毒素基因阳性临床株以ST1 克隆群为最大克隆群（ 22 株） ,其次为 ST5 克隆群（ 7 株） 和 ST239 克隆群（ 4 株） .与中国其他地区临床株比较，宁波肠毒素基因阳性临床株中出现了 7 个新的 ST,分别是 ST59、ST12、ST1121、ST573、ST20、ST6 和 ST7.结果见图 1.
2. 3 肠毒素基因阳性金黄色葡萄球菌系统进化树分析 45 株肠毒素基因阳性菌株按照形成 ST 的顺序将7 个管家基因连接成长度为 3186 bp 的多基因序列，利用 Mega 6.0 软件采用 Maximum Likelihood 方法绘制系统进化树。从图2 可知，45 株菌株在进化树上主要形成7 个分支。以 ST1-2008H165-AC 菌株作为标准序列，其他条序列共出现 69 个碱基变异位点，总碱基变异数为404,变异率为0.28%.ST573 和ST1121 在进化树上与 ST1 处于同一分支。ST188 与 ST1 在进化树上处于不同分支，与 ST88 在进化树上的距离比较近。
ST630 与 ST239 处于同一分支上，ST965 和 ST5 处于同一分支。在 ST1 菌株所在的分支中，有16 株菌株携带sea,12 株菌株携带 sec.在 14 株 ST1 菌株中，12 株携带sea,7 株携带 sec.2013 年分离的 6 株 ST1 菌株中有 3株同时携带肠毒素基因 sea 和 seb.在 2012 年和 2013年分离的菌株中检测到6 株 ST5 菌株，其中有4 株携带 sed.3 株 ST239 菌株均为2013 年检出，并且携带的肠毒素均为 sea.
3 讨论
湖南曹虹等[7]发现124 株金黄色葡萄球菌临床株中，4 种肠毒素基因（ sea、seb、sec 和 sed） 携带率依次为 90. 5%、6. 9%、65. 5% 和 5. 2%.安徽汪永禄等[8]发现 55 株临床株中 4 种肠毒素基因携带率依次为14. 55%、9. 09%、12. 73%和7. 27%.宁波155株临床株中 4 种肠毒素基因携带率则为 16. 77%、5. 81% 、11. 61% 和 3. 87% ,与安徽的结果接近。同一株金黄色葡萄球菌可以检测到 2 种或 2 种以上肠毒素基因型，且不同基因型的检出率与菌株有一定的关联度[9].曹虹等[7]和陈智等[10]均发现sea 与 sec 呈现出一定的连锁关系。在本次研究中也发现了同样的现象，在 45 株肠毒素阳性菌株中，sea 与 sec 同时阳性的菌株有 8 株，阳性率高达17. 78% .但是 155 株临床株最多能同时检测到 2种肠毒素，形成 8 种肠毒素基因组合，与以上结果不相符。
目前在 MLST 数据库中金黄色葡萄球菌可以分成 2840 种 ST,共收录了 4929 株菌株的相关信息，其中中国临床菌株有 156 株。按照 ST 单点变异型（ single-locus variant,SLV） 值≥3 为一个克隆群，具有最大 SLV 值的 ST 为主要起源。经 eBURST V3 分析显示，201 株中国临床株（ 包括 MLST 数据库中国临床株和宁波肠毒素基因阳性临床株） 分为 11 个克隆群。宁波肠毒素基因阳性临床株以 ST1 克隆群为流行优势菌群，其次为 ST5 克隆群和 ST239 克隆群。Xiao 等[11]对来自中国大陆 27 个省 45 个城市的 69 家医院分离的 1141 株耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌 （ methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA） 进行 MLST 分型，这些菌株可以分成 36 个ST,属于 7 个克隆群，ST239 克隆群为流行优势菌群（ 整体流行率为 75. 37%） ,其次为 ST5 克隆群（ 整体流行率为 12. 62%） 和 ST59 克隆群（ 整体流行率为7. 27% ） ,ST1 克隆群居于第四位 （ 整体流行率为0. 96% ） .Xie 等[12]研究发现分离自中国 14 个省份的 108 株金黄色葡萄球菌可以分为 25 个 ST,这 25个 ST 属于16 个克隆群，其中 ST239 克隆群有 35 株为流行优势菌群，其次为 ST1 克隆群（ 11 株） 和 ST5克隆群（ 10 株） .温州地区 2002 年 12 月至 2008 年6 月分离自皮肤和软组织感染的 111 株金黄色葡萄球菌以 ST239 为流行优势菌群[13].中国其他地区临床株以 ST239 克隆群为流行优势菌群，ST1 克隆群和 ST5 克隆群紧跟其后。这种差异可能与宁波菌株均携带肠毒素基因或者菌株分离的时间地点、来源不同有关。与中国其他地区临床株比较，宁波肠毒素基因阳性临床株中出现了 7 个新的 ST,分别是ST59、ST12、ST1121、ST573、ST20、ST6 和 ST7.ST59、ST20、ST7 和 ST6 在近年中国其他地区的研究中 陆 续 被 发 现[11,13 -15]. 因 此 ST12、ST573 和ST1121 是在我国境内新发现的 ST.45 株肠毒素基因阳性临床株在进化树上主要分为 7 个分支。ST573、ST1121 均属于 ST1 克隆群，因此在进化树上与 ST1 菌株处于同一分支；ST630 与同一克隆群的创建者 ST239 菌株处于同一分支上，同理 ST965 和 ST5 菌株处于同一分支，与 eBURST V3 软件分析结果保持一致。但是两种软件在数据分析上又有区别，ST188 为 ST1 克隆群的亚群，但在进化树上处于不同分支，ST88 和ST188 处于不同的克隆群，在进化树上的距离却比较近，因此要结合这两种软件对数据进行综合分析。
在系统进化树上可以看出，肠毒素基因的分布与菌株的 ST 呈一定的连锁关系，并随菌株分离的时间变化。ST1 克隆群以携带 sea（ 16 株） 和 sec（ 12株） 为主，尤其是 ST1 菌株，sea 和 sec 的阳性率高达85. 71% 和 50. 00% .但是 2013 年分离的 6 株 ST1菌株中却有 3 株同时携带 sea 和 seb.在 2012 年和2013 年分离的菌株中检测到 ST5 克隆群，该克隆群携带 sed 的阳性率高达 57. 14%.3 株 ST239 菌株均为 2013 年检出，并且携带的肠毒素均为 sea.以上这些发现还需要进行深入的研究。
参 考 文 献
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