在组织工程中,生物活性生长因子可以促进其特定的种子细胞的增殖及分化,从而实现关节一体化各个区域的构建[1-4].但生长因子极易被体内的蛋白酶所分解,生物利用度低,不能有效发挥其生物学作用[5-7].
为了解决这些问题,本课题组运用发酵技术开发出了一种新型多聚羟基烷酸-羟基丁酸与羟基辛酸共聚物(PHBHOx),不仅具有多聚羟基烷酸-羟基丁酸的通性[8-10],而且其柔韧性与加工性能得到较大改善[11-12].
本课题制备 PHBHOx 载血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)纳 米微球 , 并探索研究该纳米微球的体外性能.
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要材料及试剂 PHBHOx(HB∶HO=9∶1,黏均分子量 1.85×105Da,由本实验室发酵生产所得);VEGF(武汉博士得生物工程有限公司,中国);二氯甲烷(天津星马克科技发展有限公司,中国);聚乙烯醇(PVA,上海研生实业有限公司,中国).
1.1.2 主要仪器 磁力加热搅拌器(浙江金坛恒丰制造有限公司,中国);超声波细胞粉碎仪(宁波新艺超声设备有限公司,中国).
1.1.3 实验动物 9 周 龄乳兔 1 只,重 量 1000 g,来源于山西医科大学实验动物中心,许可证号:SYXK(晋)2009-0004.
1.2 方法
1.2.1 载 VEGF 纳米缓释微球的制备 称取一定量的PHBHOx 溶于 2 ml 二氯甲烷(含 5% Tween 80,1% Span80) 中 加热溶解 , 作为溶液 1, 取 10 μg VEGF 溶 于0.5 ml PBS 液中作为溶液 2,按 3%的浓度秤取一定量的 PVA 溶于 20 ml 蒸馏水中,加热搅拌溶解后,降至常温,作为溶液 3. 调节超声波细胞粉碎仪,输出功率为 250 W,有效时间 30 s,冰浴条件下,用超声波细胞粉碎仪超声溶液 1 与 2 至乳状.将溶液 3 加入到乳状混合液中,调节超声波细胞粉碎仪,输出功率为 450 W,同前超声,至乳状.将混合乳状液在常温下,机械搅拌5 h,除去二氯甲烷,15 000 r/min 高速离心除去游离药物与表面活性剂(PVA;Tween 80;Span 80),用 PBS液充分洗涤 3 次,共约 700 ml,分别用不同孔径微孔滤膜由大到小依次过滤,滤出物经冷冻干燥仪冷冻干燥后,并60Co 灭菌备用.
1.2.2 兔肾微血管内皮细胞的分离传代培养 采用三步梯度筛网法[13-14]进行分离及培养. 空气栓塞处死乳兔后取双肾,体积分数 75%乙醇浸泡 5 min,Hank 缓冲液漂洗 3 次,剥离被膜和脂肪组织,取肾皮质,剪成约1 mm×1 mm×1 mm 组织块,置于 100 目尼龙滤网上研磨,滤过物置于 150 目滤网上研磨,最后用 200 目尼龙滤网搜集滤过物;M199 培养液冲洗并搜集滤过物,1200 r/min 离心 5 min,离心半径 15.5 cm,弃上清液,用 0.1%Ⅳ型胶原酶 (1 g/L)37℃消化滤过物 30 min,离心,取积淀物用 M199 培养液(含体积分数 20%胎牛血清,0.02 mg/L 血管内皮细胞生长因子,青、链霉素各 100 U/ml)吹打匀称,细胞计数,以 1×1010/L 细胞浓度置于 25 ml 培养瓶作原代培养,倒置显微镜下察看细胞状态. 72 h 后首次换液,随后每隔 48 h 换液,待细胞增殖融合至 80%~90%时,以 0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙胺四乙酸)消化传代,1∶2 传至第 3 代备用.
1.2.3 实验分组 实验分组依据所含成分的不同分为3 组.A 组:VEGF 组;B 组:纳米微球组;C 组:对照组.A 组 为单纯 10%胎 牛血清 DMEM 液+VEGF;B 组 将VEGF-P(HBHO)NPs 加入 10%胎牛血清 DMEM 液.C组为没有添加药物的 10%胎牛血清 DMEM 液(对照组).
前两组培养液中 VEGF 浓度分别设为 10、20、50 ng/ml3 个浓度. 提取培养至第 3 代 的兔肾微血管内皮细胞,用培养液调整浓度至 1×107个/L,接种到 96 孔板上,每孔 200 μl. 使细胞同步生长后,隔天换液 1 次,并于 1、3、5、7、10 d 收集细胞,A、B 两组每个时相点设置 4个重复测量孔,C 组每个时相点设置 2 个重复测量孔.
1.2.4 MTT 法检测缓释纳米微球对肾血管内皮细胞活力的影响 分别于培养 1、3、5、7、10 d,常规先后加入5%四 甲基偶氮唑盐 (MTT)20 μl,经过 4 h 后 再加入二甲基亚砜 150 μl,低速振荡,用酶联免疫检测仪依次测量各孔的吸光度值,检测波长为 490 nm,以反映VEGF 对肾微血管内皮细胞活力的影响.
1.3 统计学处理本研究所得数据均采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计分析,计数资料以 x±s 表示,采用 t 检验,计数资料采用方差分析,以 P<0.05 为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 纳米微球及肾微血管内皮细胞形态的观察
纳米缓释微球表面形态,基本完整,大小较均一,分散性可;载药纳米微球的平均粒径为(524.75±67.46) nm(图 1). 肾微血管内皮细胞呈短胖梭形,镶嵌分列,互不堆叠,产生接触抑制呈铺路鹅卵石形(图2).
2.2 载 VEGF 缓释纳米 微球载药量与包封率 的 测定结果
采用 ELISA 法在 450 nm 波长处,测定某一标准孔的 OD 值,吸光度(A)与浓度(C)呈较好线性关系,回归方程为:A=0.002C+0.122,r²=0.997(表 1、图 3).
根据公式,载药量=(微球中所含药物重/微球的总重)×100%;包封率=(系统中包封与未包封的总药量-液体介质中未包封的药量/系统中包封与未包封的总药量)×100%;得到载 VEGF 缓释纳米微球的载药量为:(1.257±0.024)×10-3%,包封率为 :(90.77±1.67)%(表 2).
2.3 PHBHOx 载 VEGF 缓释纳米微球体外释 药率的测定
精确称取 10 mg 纳米粒分散于 100 ml pH 7.4 的PBS 液中,水浴恒温 37℃,并以一定的速度低速搅拌,分别在 0、1、3、5、7、9、11、13、15 d 取样 5 ml,同时补充同体积的 PBS,立即对样液进行离心(15 000 r/min,10 min),取上清 10 μl,测 OD 值,代入标准曲线回归方程,计算累积释药百分数,并制图(x 轴释药天数,y轴释药百分比).在第 1 天内微球释药速率较快,这可能与微球迅速吸水溶胀,而快速的释放包被的生物活性因子;同时也未超过 20%,5 d 释药率可达 50%,14 d可达 90%的释药率,这段时间微球的释药率逐渐减慢,这可能与微球以自身降解来释放药物有关(图 4).
2.4 不同浓度的单纯 VEGF、VEGF-P(HBHO)NPs 及对照组对肾微血管内皮细胞增殖检测的结果
培养 1~3 d,A 组与 B 组比较,差异无统计学意义(P>0.05),即肾微血管内皮细胞在不同形式的生物活性因子的作用下,增殖无明显差别;C 组与 A、B 组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),表明 VEGF 可显着促进肾微血管内皮细胞的增殖;共培养 5~7 d,A 组与 C 组比较,差异有统计学意义,说明 VEGF 可继续促进肾微血管内皮细胞的增殖,B 组与 A、C 组比较,差异均有统计学意义,表明缓释纳米微球缓慢持续的释放 VEGF;共培养 7~10 d,A 组与 C 组比较,差异无统计学意义,即 VEGF 的生物活性可能丧失,无法发挥其促进肾微血管内皮细胞增殖分化的作用;B 组与A、C 组 比较,差异均有统计学意义 (P<0.01),表明载VEGF 的 纳米缓释微球仍然可以缓慢释放生物活性因子,在很大程度上,延长了生物活性因子的作用时间,显示出纳米粒子的缓释作用(表 3).
3 讨论
在组织工程中,生物活性生长因子可以促进其特定的种子的增殖及分化[15-16],这其中 VEGF 可 以为关节一体化支架基质区的构建提供生长因子[17-18],同时可以有效促进关节周围肉芽组织生长以及在创伤修复中的伤口愈合[19-20]. 但由于 VEGF 本身属于一种蛋白质,极易被体内的蛋白酶降解,短时间内就会被代谢,因而自身组织的修复不能被充分满足,研究生长因子缓释微球,可以为组织工程技术修复软骨损伤铺平道路.
本研究通过超声乳化法[12,21]制备载 VEGF 缓释纳米微球,并与肾微血管内皮细胞共培养,肾微血管内皮细胞在不同形式的生物活性因子的作用下,增殖无明显差别,可能与缓释纳米微球迅速吸水溶胀,从而快速释放出所包被的生物活性因子有关;VEGF 可显着促进肾微血管内皮细胞的增殖;包被在载体中的生物活性因子随着载体材料的降解而缓慢持续释出,从而显着提高生物活性因子的生物利用度,在较长的一段时间内可继续促使肾微血管内皮细胞的增殖,在很大程度上,延长了生物活性因子的作用时间,显示出纳米粒子的缓释作用.
综上所述,采用超声乳化法制备的载 VEGF 缓释纳米微球,可以一定速率释放 VEGF,可以持续有效的较长时间促进肾血管内皮细胞的增殖及分化.制备的载药纳米粒子初期快速释药,使单纯使用生长因子与载药粒子无明显差异,而后期,包被的药物通过载体材料的降解而缓慢持续释药,缓释纳米粒子的缓释作用得到显着体现,这也说明纳米粒子释放规律基本遵守降解扩散控制原则[22-25]. 但由于时间因素,未能做在体内环境下,实施纳米微球与支架复合后的损伤修复实验,有待进一步的研究证明该微球的生物学意义和应用价值.
[参考文献]
[1] Seil JT,Webster TJ.Antimicrobial applications of nan-otechnology:methods and literature[J].Int J Nanomedicine,2012,7:2767-2781.
[2] Tiwari M.Nano cancer therapy strategies[J].J Cancer ResTher,2012,8(1):19-22.
[3] Kawagachi T,Tsugane A,Higashide K,et al.Control of drugrelease with a combination of prodrug and polymer ma-trix:antitumor activity and release profiles of 3′ ,5′-dia-cyl-5-fluoro-2′-deoxyurkline from poly (3-hydroxybutyrate) microspheres[J].J Pharm Sci,1992,81(6):508-512.
[4] Liu Y,Tan J,Thomas A,et al.The shape of things to come:importance of design in nanotechnology for drug delivery[J].Ther Deliv,2012,3(2):181-194.
[5] Desai N.Challenges in development of nanoparticle-basedtherapeutics[J].AAPS J,2012,14(2):282-295.
[6] Pouton CW,Akhtar S.Biosynthetic polyhydroxyalkanoatesand their potential in drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev,1996,18(2):133-162.
[7] Koosha F,Muller RH,Davis SS.Polyhydroxybutyrate as adrug carries[J].Crit Rev Ther Darrier Syst,1989,6(2):117-130.
[8] Bosetti M,Boccafoschi F,Leigheb M,et al.Chondrogenicinduction of human mesenchyal stem cells using combinedgrowth factors for cartilage tissue engineering [J].J TissueEng Regen Med,2012,6(3):205-213.
[9] de Koning GJM,Lemstra PJ.Crystallization phenomena inbacterial poly[(R) -3-hydroxybutyrate]:3.Toughening viatexture changes[J].Polymer,1994,35(21):4598-4605.
[10] Li S,Ji Z,Zou M,et al.Preparation,characterization,pharmacokinetics and tissue distribution of solid lipidnanoparticles loaded with tetrandrine[J].AAPS Pharm Sci Tech,2011,12(3):1011-1018.
[11] Ozturk K,Caban S,Kozlu S,et al.The influence of tech-nologicalparameters on the physicochemical properties ofblank PLGAnanoparticles [J].Pharmazie ,2010 ,65 (9 ) :665-669.
[12] Park YM,Lee SJ,Kim YS,et al.Nanoparticle-based vac-cine delivery for cancer immunotherapy[J].Immune Netw,2013,13(5):177-183.
[13] Rolbblat G.Growth,nutrition,and metabolism of cell inculture[M].New York:Academic Publishers,1977.
[14] Manke A,Wang L,Rojanasakul Y.Mechanisms of nanopar-ticle-induced oxidative stress and toxicity[J].Biomed ResInt,2013,2013:942916.
[15] Li C,Li L,Keates AC.Targeting cancer gene therapy withmagnetic nanoparticles [J].Oncotarget,2012,3 (4):365 -367.
[16] 张 纲.bFGF、rhBMP-2 聚乳酸纳米微球促 进下颌骨骨折愈合的实验研究[D].重庆:第三军医大学,2007.
[17] 陈璋,张婵,郭羽,等.羟基丁酸与羟基辛酸共聚物载阿霉素缓释纳米微球的研究[J].山西大学学报(自然科学版),2009,32(2):258-262.
[18] 郭羽,董岳峰,陈璋,等.羟基丁酸与羟基辛酸共聚体骨组织工程支架的初步研究[J].功能材料,2009,40(3):459-462,466.
[19] Havla JB,Lotz AS,Richter E,et al.Cartilage tissue engi-neering for auricular reconstruction in vitro evaluation ofpotential genotoxic and cytotoxic effects of scaffold mate-rials[J].Toxicol In Vitro,2010,24(3):849-853.
[20] Agarwal S,Wendorff JH,Greiner A.Use of electrospinningtechnique for biomedical applications [J].Polymer,2008,49(26):5603-5621.
[21] Sun ML,Zhang H.The development of nanoparticles onDNA isolation and purification[J].Sheng Wu Gong ChengXue Bao,2001,17(6):601-603.
[22] Park H,Hwang MP,Lee KH.Immunomagnetic nanoparti-cle - based assays for detection of biomarkers [ J ] . Int JNanomedicine,2013,8:4543-4552.
[23] Ba觡obre-López M,Teijeiro A,Rivas J.Magnetic nanopar-ticle-based hyperthermia for cancer treatment [J].RepPract Oncol Radiother,2013,18(6):397-400.
[24] Cohen NP,Foster RJ,Mow VC.Composition and dynam-ics of articular cartilage:structure,function,and main-taining healthy state[J].J Orthop Sports Phys Ther,1998,28(4):203-215.
[25] Rim KT,Song SW,Kim HY.Oxidative DNA damage fromnanoparticle exposure and its application to workers′health:a literature review[J].Saf Health Work,2013,4(4):177-186.
