迁移侵袭抑制蛋白（ MIIP） 是近些年被发现的新的候选肿瘤转移侵袭抑制基因，在染色体上定位于 1p36. 22,该区域在包括乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤和 神 经 母 细 胞 瘤 等 多 种 肿 瘤 中 常 出 现 缺失.自 2003 年 MIIP 被 Song 等研究者发现能够抑制多形性胶质母细胞瘤侵袭和转移能力以来，陆续有研究报道了其作用的可能分子机制，包括与胰岛素生长因子结合蛋白（ IGFBP） - 2 结合，中和其促进肿瘤转移的作用; 降低 HDAC6 的稳定性及活性，从而影响组蛋白去乙酰化酶 6（ HDAC6） 对微管系统的乙酰化调节，抑制神经胶质瘤细胞的迁移能力等。此外，研究还发现 MIIP 基因的突变转录本不能够抑制肿瘤的侵袭能力,从而进一步证实了 MIIP 的抑癌作用。目前，MIIP 抗肿瘤侵袭转移作用的详细机制还不明确。2010 年，一项病例对照研究的结果表明，MIIP 基因的 rs2295283SNP 位点（ codon 167,A > G,K > E） 与乳腺癌的发病风险具有相关性，AG + GG 基因型是乳腺癌的保护因素； 对瘤块体积 > 2 cm 及中晚期的乳腺癌患者，GG 基因型能够降低其易感性； 而且，具有 MIIP- G 型等位基因的乳腺癌细胞，其克隆形成能力降低.对 MIIP 蛋白的氨基酸序列分析发现，在 MI-IP 蛋白的第 81 ~ 89、143 ~ 151、173 ~ 181 及 314 ~322 位氨基酸的位置，包含四个可能与 CDC20 （ celldivision cycle 20 ） 识别结合的破坏框 （ Destructionbox,D box） 结构域; 当 MIIP 与细胞周期调节蛋白 CDC20 直接结合后，能够调节有丝分裂后期促进复合物 APC/C 的活性，抑制细胞周期调节素 Cy-clin B1 的降解来阻止有丝分裂的进行.MIIPrs2295283 SNP 位点恰好临近 MIIP 的第 3 个破坏框结构域，因而推测该位置单个核苷酸的改变是否会影响 MIIP 与 CDC20 的结合能力而调节细胞的增殖能力。为此，本研究构建了 167 位氨基酸发生K > E 突变的 MIIP 原核表达载体，为后续研究 MIIP的抗肿瘤机制奠定工作基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒： 大肠杆菌 DH5α 感受态和 BL21感受态为本实验室制备； GEX -4T -1 - MIIP 重组质粒为本实验室构建。
1. 1. 2 主要试剂： Pfu 高保真 DNA 聚合酶为 NEB公司产品； Peasy - T1 载体购自北京全式金生物公司； 质粒小量提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自北京天根公司； 限制性内切酶 Xho I 和 EcoR I 及 T4DNA 连接酶为 PROMEGA 公司产品； 异丙基硫代 -β - D 半乳糖苷（ isopropyl - β - D - thiogalactoside,IPTG） 、溶菌酶和 PMSF 购自 Amresco 公司； Glutathi-one Agarose 为 Invitrogen 公司产品； 1kbDNA 分子量标准、蛋白分子量标准购自天根公司； DNA 分子量标准（ DL15000） 购自 TaKaRa 公司。
1. 1. 3 引物的设计与合成： 根据 MIIP 基因序列（ GenBank A ccession N umber: NM_021933. 2） 及167位氨基酸所在的编码序列位置，在其前端和后端分别设计两对引物，同时分别在前端的上游引物和后端的下游引物的 5‘端分别引入 Xho I 和 EcoRI 的酶切位点。所用引物为，上游 -1: 5'- CGGAATTCAG-GATGGTGGAG GCTGAGGAAC - 3',下游 - 1: 5'-GCCAGCTCCTCTCAGGAACTGCAG - 3 '; 上游 - 2:5'- TCTGCAGTTCCTGAGAGGAGCTGGC - 3',下游- 2: 5 '- CCGCTCGAGT CAGGGCTTCTGCCGTGG-GAC - 3'.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表达载体的构建： 以 pGEX - 4T - 1 - MIIP 质粒为模板，分别以第 167 位氨基酸（ aa） 前端和后端序列的两对引物扩增出 MIIP 167aa 的前后两端序列； 然后以混合的前后两端序列，不加引物先扩增 5 个循环后，在体系中加入上游 -1 引物和下游 -2 引物，继续扩增 30个循环获得 MIIP（ K167E） 突变体的 cDNA 序列。
PCR 扩增条件： 98 ℃ 预变性 30 s,然后 98 ℃ 10 s,60℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30 ~ 35 个循环后，最后于 72 ℃延伸 10 min.扩增产物加 poly - A 尾后，与 pEASY- T1 克隆载体于 25 ℃ 下连接 20 min,转化入 E. coliDH5α 感 受 态 细 胞，获 得 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 重组质粒； 将其用 Xho I 和 EcoRI 双酶切进行鉴定，鉴定正确的 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 和pGEX - 4T - 1 空质粒分别再用 Xho I 和 EcoRI 酶切，产物回收后进行连接转化及酶切鉴定，鉴定正确的 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证。
1. 2. 2 GST - MIIP （ K167E） 融合蛋白的表达的纯化： 将 pGEX -4T - 1 - MIIP（ K167E） 重组质粒转化入 E. coli BL21 感受态细胞后，挑取单克隆菌落于 3mL 的 LB 培养液（ 含 50 μg·mL- 1的氨苄青霉素） 中37 ℃ 震荡培养过夜。次日按 1∶ 100 稀释菌液至适量LB 培养液中（ 含 50 μg·mL- 1的氨苄青霉素） ,37 ℃扩增培养至 OD600 nm约为 0. 8 时，加入终浓度为 0. 2mM 的 IPTG 在 25 ℃ 诱导表达 4 h 后，12 000 ·min- 1,4 ℃ 离心，弃上清； 菌体沉淀用细菌裂解液（ 含 1 mg·mL- 1溶菌酶，1mM PMSF,1% TritonX -100,1. 5% 十二烷基肌氨酸钠） 冰上裂解 30 min 后，间歇超声至菌液清亮； 离心收集上清，加入 Glutathi-one 琼脂糖珠，4 ℃ 过夜结合。次日，离心吸去上清，Glutathione 琼脂糖珠经 PBS 洗涤后，用还原性谷胱甘肽洗脱液洗脱获得纯化的 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白。
2 结果
2. 1 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表达载体的构建和鉴定
2. 1. 1 扩增获得 MIIP（ K167E） 突变体 cDNA 全长序列： MIIP 蛋白共有 388 个氨基酸组成，cDNA 全长约为1 164 bp,故第167 位氨基酸前端的碱基序列为501 bp,后端碱基序列约为 663 bp,全长 cDNA 加上引物两端引入的酶切位点共约 1 180 bp.以pGEX -4T - 1 - MIIP 重组质粒为模板，经第一次 PCR 反应后，分别扩增出了第 167 位氨基酸前端和后端序列 ; 随后以前后两端序列混合后为模板，扩增出 MIIP（ K167E） 突变体的cDNA 全长序列.
2. 1. 2 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 重组质粒的构建和鉴定： 将 PCR 扩增获得 MIIP（ K167E） 突变体的全长 cDNA 与 pEASY - T1 克隆载体进行连接后，获得 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 重组质粒。将其转化至大肠杆菌感受态细胞 DH5α，筛选阳性克隆用 XhoI 和 EcoRI 进行双酶切鉴定。pEASY - T1 载体大小约为 4 900 bp,MIIP（ K167E） 全长 cDNA 约为 1 180bp,构建成功的重组质粒经酶切后可释放出大小约4 900 bp 和 1 180 bp 的 2 个片段，图中泳道 4 和 5 为酶切鉴定正确的质粒。
2. 1. 3 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表达载体的构建和鉴定： 将 pGEX -4T -1 质粒及酶切鉴定正确的 pEASY - T1 - MIIP（ K167E） 载体分别用 XhoI 和 EcoR I 双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳； 回收酶切后的 MIIP（ K167E） 片段和 pGEX -4T -1 载体，将两者连接转化后获得 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E）重组质粒，挑取 4 个阳性克隆用 Xho I 和 EcoR I 进行双酶切鉴定 .
pGEX - 4T - 1 载体约为 5 400 bp,泳道 2、3 和 4 的重组质粒经酶切后，均可释放出5 400 bp 和1 180 bp大小的 2 个片段。从中选取 2 个重组体进行测序，结果与 GenBank 中公布的 MIIP cDNA 编码序列比对后，证实所选阳性质粒编码第 167 位氨基酸的密码子（ AAG） 的第 1 位碱基均发生了 A 到 G 的突变，提示 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 突变体重组质粒构建成功。
2. 2 pGEX - 4T - 1 - MIIP（ K167E） 原核表达载体的诱导表达及纯化： 以0. 2 mM IPTG 对 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 原核表达载体在 25 ℃ 诱导表达 4h 后，收集诱导的菌体沉淀，用酶法及超声法进行裂解，离心后收集上清，沉淀用同等体积的 PBS 垂悬后，对诱导获得的全菌、菌液上清及沉淀行 SDS -PAGE 电泳并染色，以观察所得 GST - MIIP（ K167E）是否为可溶性表达。结果如图 3 所示（ 目录后） ,与未诱导菌液相比，诱导后的全菌在 65 kDa 左右的位置上可见 1 条明显的特异性蛋白带（ GST 标签分子量为26 kD,MIIP（ K167E） 蛋白分子量约为43 kD,故GST - MIIP 融合蛋白分子量约为 69 kD） .全菌经裂解后，在上清及沉淀中均可观察到 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白条带，提示 GST - MIIP 融合蛋白部分以可溶性形式进行表达，部分形成了不溶性的包涵体。
随后，采用 Glutathione 琼脂糖珠，对存在于上清中可溶性的 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白进行了纯化。经纯化后，获得了纯度相对较高的 GST - MIIP（ K167E） 融合蛋白。
3 讨论
侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是临床上绝大多数肿瘤患者的致死原因。肿瘤的侵袭转移是多因素、多步骤、多基因相互协调作用的复杂过程。
MIIP 是新近发现的一个潜在的肿瘤转移抑制基因，在染色体上定位于1p 36.22,基因全长12.6 kb,编码388 氨基酸组成的蛋白质，蛋白分子量约为 43 kD.
MIIP 蛋白有较强的亲水性，具有 3 个 SEG domain 和 1个能与整合素结合的 RGD motif.此外，在其第 81 ~89、143 ~ 151、173 ~ 181 及 314 ~ 322 位氨基酸的位置，包含 4 个破坏框（ Destruction box,D box） 结构域.
D box结构域是一段由 9 个氨基酸组成的特殊的序列（ RXXLXXXXN,X 代表任意氨基酸） ,其中第 1 位的精氨酸（ R） 和第 4 位的亮氨酸（ L） 高度保守。含有D box结构域的蛋白被认为是控制细胞周期进程的后期促进复合体/周期体（ APC/C） 蛋白复合体的底物，可通过与 APC/C 的共激活因子 CDC20 或 Cdh1 结合而募集在 APC/C 复合体的周围。一般情况下，作为一种泛素连接酶 E3,APC/C 会促进底物蛋白质的泛素化降解。这一过程对细胞周期的正常进行具有重要的调节作用，正是在 APC/C 的作用下，Cyclin B1 发生降解，进而 CDK1 完全失活，才使得有丝分裂从中期进入后期.在多种恶性肿瘤中，均出现了 APC/CCdc /20 或 APC / CCdh1 复合物的功能失调，这种失调，可能引起细胞中抑癌蛋白的过度降解或者癌蛋白在的大量蓄积。Ji 等的研究结果显示，MIIP 的高表达能够抑制多种肿瘤细胞（ 如神经胶质瘤细胞、结肠癌细胞、子宫内膜癌细胞及乳腺癌细胞） 的体外增殖能力； 进一步的分子机制研究表明，MIIP 可能是一个有丝分裂检查点蛋白，是 APC/C 的关键调节因子，可通过与 CDC20 结合来调节 APC/C 的活性，进而抑制细胞周期调节素 Cyclin B1 的降解来阻止有丝分裂的进行.
在一项病例对照研究中，研究者发现 MIIPrs2295283 SNP 位点的差异与乳腺癌的发病风险相关.该 SNP 位点从 A > G 的单个碱基的改变，使MIIP 蛋白 NH2 末端第 167 个密码子编码的氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸。其中，AG + GG 联合基因型者乳腺癌的发病风险要低于 AA 基因型者。同时，他们还发现，具有 MIIP 167E（ G 变异性） 乳腺癌细胞的体外增殖能力减弱。由于第 167 位氨基酸与上述MIIP 的第 3 个 D box 结构域（ 173 ~ 181） 非常接近，这一位置的氨基酸改变极有可能影响到该 D box 结构域的功能，进而可能会影响 MIIP 与 CDC20 的结合及对 APC/C 的调节作用，因而表现出细胞增殖能力的改变。为此在本研究中，我们构建了 pGEX -4T -1 - MIIP（ K167E） 突变体重组质粒，并对其进行了表达和纯化，为进一步探索 MIIP 的分子功能、解释其分子作用机制提供一个有力的研究工具。
[参考文献]
[1] Varma G,Varma R,Huang H,et al. Array comparative genomic hy-bridisation（ aCGH） analysis of premenopausal breast cancers from anuclear fallout area and matched cases from Western New York[J].Br J Cancer,2005,93: 699 - 708.
[2] Fujita T,Igarashi J,Okawa ER,et al. CHD5 a tumor suppressorgene deleted from 1p36. 31 in neuroblastomas[J]. J Natl CancerInst,2008,100: 940 - 949.
[3] Gibbs M,Stanford JL,McIndoe RA,et al. Evidence for a rare pros-tate cancer - susceptibility locus at chromosome 1p36[J]. Am JHum Genet,1999,64: 776 - 787.
[4] Janoueix - Lerosey I,Novikov E,Monteiro M,et al. Gene expressionprofiling of 1p35 - 36 genes in neuroblastoma[J]. Oncogene,2004,23: 5912 - 5922.
[5] Song SW,Fuller GN,Khan A,et al. IIp45 an insulin - like growthfactor binding protein 2 （ IGFBP - 2 ） binding protein,antagonizesIGFBP - 2 stimulation of glioma cell invasion[J]. Proceedings ofthe National Academy of Science,2003,100（ 24） : 13970 - 13975.
[6] Wu Y,Song SW,Sun JY,et al. IIp45 inhibits cell migration throughinhibition of HDAC6[J]. The Journal of Biological Chemistry,2010,285（ 6） : 3554 - 3560.
