血小板输注是临床输血的重要组成部分,已成为治疗各种原因引起血小板减少症的最有效的手段之一。研究表明,绝大多数已知的人类血小板抗原(human platelet antigen,HPA)位于糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物上。近年来,随着分子生物学的发展,人类血小板抗原系统的分子机制已经明了,传统的血小板抗原的血清学检测方法已经逐渐被分子生物学技术所代替,这种改变对于利用实验室检测来诊断同种免疫性血小板疾病具有重要的意义。此外,基因检测HPA系统中各种抗原的等位基因,是研究那些可能含有HPA抗体患者所必须的,并可为血小板输注无效(PTR)患者提供HPA相合的血小板。笔者利用PCR-SSP技术鉴定HPA的基因型,从而建立一套适合本地区HPA的基因鉴定方法,现报告如下。
材料与方法
1 样本来源 随机选择2011年5～12月洛阳市中心血站无血缘关系的献血者400例,其中男性267例,女性133例,年龄24～47岁。静脉抽取献血者外周血5 ml,枸橼酸盐抗凝。
2 主要仪器与试剂 PCR仪由美国ABI公司提供,PCR扩增试剂盒购自大连宝生物工程公司,血液基因组小量提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司。
3 DNA提取 严格按试剂说明书操作。
4 PCR反应
4.1 引物合成:参考文献[3]合成相关引物,由上海生工生物工程公司合成,用TE Buffer稀释为5μmol/L应用液,于-20℃保存备用。
4.2 PCR反应:根据各引物GC%及Tm值的差异,分别选择以下反应体系:(1)50μl反应体系:2×GC BufferⅠ25μl,dNTP Mixture 8μl,正、反向引物(HPA-2、3、6、9、10、12)各20μmol/L,内参引物各5μmol/L,模板DNA 200 ng,TaKaRa LATaq(5 U/μl) 0.5μl,灭菌去离子水补充至50μl。扩增条件:95℃5 min;95℃30 s,58℃40 s,72℃30 s,35个循环;72℃5 min,降温至4℃保存。(2)50μl反应体系:10×Ex Taq Buffer 5μl,dNTPMixture 4μl,正、反向引物(HPA-1、13、15、16)各20μmol/L,内参引物各5μmol,模板200 ng,TaKaRa Ex Taq(5 U/μl) 0.25μl,灭菌去离子水补充至50μl。扩增条件:95℃5 min;95℃45 s,56℃40 s,72℃30 s,35个循环;72℃5 min,降温至4℃保存。
4.3 产物分析:取PCR产物2μl,灭菌去离子水7μl,10×Loading Buffer 1μl,混匀,上样,在1×TAE缓冲液中用100 V电压电泳20 min,紫外灯下观察结果并拍照保存。
结 果
1 洛阳地区血小板抗原等位基因分型(PCR-SSP)结果见图1。
2 洛阳地区HPA基因检测及等位基因(a和b)分布见表1。
讨 论
人类血小板表面复杂的血型抗原可分为两大类,即血小板相关抗原和血小板特异性抗原(HPA)。HPA系统是由于编码血小板膜糖蛋白基因发生单个核苷酸替换而形成的,均由高频基因“a”和低频基因“b”2个等位基因组成[4]。所有血小板抗原的双等位基因多态性的分子基础与血小板糖蛋白(GP)变异体有关,如GPⅡb、GPⅢa、GPⅠb及GPⅠa等,而这些因氨基酸置换产生的糖蛋白变异体与血小板特异性抗原发生同种免疫的概率密切相关。因同种免疫产生的血小板抗体可导致新生儿免疫性血小板减少症(NAIT)、输血后紫癜(PTP)以及血小板输注无效(PTR)等,是临床输血中不能忽视的问题。
本研究收集了400例无偿献血者样本,对洛阳地区血小板抗原系统的主要抗原进行基因检测,并计算这些抗原在随机输血中发生不合的概率。结果发现,所检测的血小板抗原中全部含有高频基因“a”,且HPA-9、10、12、13、16均为“aa”纯合子。低频基因“b”出现的频率较低,仅在HPA-2、3、15发现了“bb”纯合子。此外,“aa”、“ab”、“bb”三种基因型在绝大多数抗原中分布差异显着,且“aa”型所占比例最大。值得注意的是,在HPA-3和15两种抗原中,3种基因型所占比例的差异并无统计学意义。
通过计算各种抗原出现随机输血不合的概率(MP),我们发现“a”、“b”两种等位基因所占比例越相近,发生输血不合的概率就越大,而均为“aa”纯合子的那些抗原,这种概率则为0。值得注意的是,在HPA-3和HPA-15中,“a”、“b”等位基因频率几乎相等(分别为0.528 8和0.471 2、0.526 3和0.473 7),而MP值也最大(分别为37.416 9%和37.430 7%)。所以,推测HPA-3和HPA-15是引起本地区血小板输注不合的主要原因,同时也可能是导致因血小板特异性抗原发生同种免疫而引起相关疾病的主要原因。
本研究成果有助于为血小板输注无效患者提供HPA相合的血小板,从而提高血小板的输注效果,同时可以辅助诊断血小板相关疾病。遗憾的是,由于本研究中收集的样本量有限,而建立本地区的血小板基因库,则需要检测HPA系统的其他抗原,如HPA-4、HPA-8等,同时应加大样本量作进一步研究。
参 考 文 献
1 Allen DL, Abrahamsson S,Murphy MF,et al. Humanplatelet antigen 1a epitopes are dependent on thecation-regulated conformation of integrinα(IIb)β(3)(GPIIb/IIIa)[J]. J Immunol Methods,2012,375(1-2):166-175.
2 周琼秀,李执如,陈静娴.PCR-SSP在人类血小板抗原1-6、15系统基因分型中的应用[J].中国输血杂志,2009,22(04):43-44.
3 Xia WJ,Ye X,Tian LW,et al.Establishment of plateletdonor registry improves the treatment of platelettransfusion refractoriness in Guangzhou region ofChina[J]. Transfus Med, 2010,20(4):269-274.
4 Xu X,Liu Y,Ying Y,et al. Human platelet antigenallele frequencies and new mutations on plateletglycoprotein genes in the Chinese Han population[J].Transfus Med,2011,21(5):330-337.
5 Brouk H, Halle L, Bertrand G,et al. Human plateletantigen allele frequencies in different Algerianpopulations[J]. Tissue Antigens, 2010, 75 (6): 673-678.
