基因技术论文（前沿范文8篇）之第五篇
摘要：基因芯片技术作为一种综合性新技术, 具有高效、灵敏、准确等优点, 目前已被广泛应用于医学的各个领域, 并在基因功能表达、致病机理、临床诊断、药物开发等研究方面取得突出成效。文章主要对基因芯片技术在兽医中的诊断、兽药开发、基因防治、动物产品检疫等方面的研究与存在问题进行综述。
关键词：基因芯片,技术,兽医诊断
人类基因组计划 (HGP) 的实施及后基因组计划的启动, 不仅破译了编码人类基因组的核苷酸序列, 还对蕴藏在其中的功能含义进行了发掘[1]。生物芯片技术是近几年发展起来的一项高效率、高通量的生物样品的检测技术, 是大规模获取生物信息的重要手段。生物芯片技术为人类基因组学从理论研究向实用研究过渡以及生命科学从分子水平研究向细胞乃至整体水平研究的回归架起了一座桥梁[2]。基因芯片是一种最重要的生物芯片, 在畜牧业快速发展的同时, 新的动物疾病不断出现, 给兽医学疾病的诊断和防治带来了很大困难。基因芯片的诞生, 不但为兽医科学的发展和科学研究提供了有效手段, 而且为动物疾病的诊断和防治提供了新的方法。
1 基因芯片技术概述
基因芯片是一项将生命学科与微电子学、化学和计算机科学等集于一体的高度交叉的尖端应用型技术, 其应用已不局限于最初的DNA序列测定, 现已在动物科学、药物筛选、药物开发、基因诊断、基因突变、基因表达分析、多态性分析和环境科学等多个领域显示出巨大的理论意义和应用价值[3]。
1.1 基因芯片技术的原理
基因芯片又称DNA微阵列芯片、DNA微阵列、DNA芯片, 其技术雏形是Southern blot技术, 是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。它是按特定的排列方式将大量的核酸片段 (寡核苷酸/DNA、c DNA、基因组DNA) 固定在硅片、玻片、塑料片上[4], 并以此为基因探针, 在一定的条件下与标记的样品中待检测的靶基因片段杂交, 将未互补结合反应的片段洗去, 通过检测杂交信号的强度与分布进行分析, 从而实现对靶基因的存在、含量及变异信息的快速检测[5]。该检测是基于基因探针和样品中的靶基因片段发生特异性的核酸杂交, 其步骤为[6]:样品处理→核酸杂交→扩增→标记→芯片制作→固化处理→基因芯片→核酸杂交→洗涤→检测→数据处理→综合信息处理。
1.2 基因芯片的种类
因制备方法和应用的不同基因芯片范围不同, 基因芯片也分为不同种类。按应用的不同, 基因芯片总体上可为两大类:基因表达谱芯片和寡核苷酸芯片[7]。根据探针核酸种类的不同, 也可划分为:寡核苷酸芯片和c DNA芯片。按介质不同, 可分为玻璃片、硅片、尼龙膜、陶瓷和微型磁珠等。根据用途的不同, 又可分为:表达谱芯片、诊断芯片、测序芯片、毒理芯片和指纹图谱芯片等。按点样方法的不同, 可分为光刻基因芯片、机械微型点样基因芯片、液体喷射技术基因芯片等。根据制备方法的不同, 可分为原位合成和直接点样。目前基因芯片制定方法有6种。
1.3 样品的准备及杂交检测
待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节。生物样品是非常复杂的生物分子混合体, 除少数特殊样品外, 一般不能直接与芯片反应, 必须将样品进行生物处理。从血液或组织中获取的DNA或RNA样品在标记成为探针前需进行扩增, 以提高阅读灵敏度[8]。选择的目的DNA必须能代表要研究的各个基因。
2 基因芯片技术在兽医临床中的应用
2.1 动物疾病的诊断
随着养殖方式从粗放型向集约型转变, 动物疾病变得越发复杂, 新的病原不断出现, 加之多种病原混合感染, 而传统的诊断方法 (如琼脂扩散、病毒分离、血凝与血凝抑制试验、ELISA等) 虽然可靠, 基因芯片技术弥补了传统诊断方法的不足, 能1次检测多种病原, 而所需样品量极少, 且具有灵敏、特异、高效的特点, 在兽医学研究中已颇显成效。王建东等[9]制备了口蹄疫病毒基因芯片。符芳等[10]研制的c DNA微阵列芯片, 采用猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型的特异c DNA片段作为探针制备而成, 能够对上述5种病毒同时快速、准确地检测, 且样品需要量极少。根据各种病毒的特异性基因片段而制备的基因芯片, 能够灵敏、高效、准确地检测多种病毒, 为动物病毒性传染病的鉴别与诊断带来了新的突破。杨朋欣等[11]将基因芯片技术用于寄生虫病的诊断, 运用旋毛虫、弓形虫的特异序列设计出特异性探针, 建立了旋毛虫、弓形虫的液相基因芯片检测方法, 从而为寄生虫的检测开拓了新的途径。
2.2 基因防治
针对病变基因序列设计基因药物或核酸疫苗, 改变靶序列及表达, 达到防治的目的。对目前难以防治的肿瘤病、烈性传染病等的防制有根本性的改变。包文奇等[6]分析研究了结核杆菌有毒株、牛型结核杆菌有毒株和牛型结核杆菌减毒活疫苗 (卡介苗BCG) 基因组之间的差异, 制作了结核杆菌有毒株基因所有开放阅读框架的DNA芯片, 进行平行的比较基因杂交。结果表明, 牛型结核杆菌有毒株相对于结核杆菌有毒株有11个基因片段的缺失, 而卡介苗相对于牛型结核杆菌有毒株有5个基因片段的缺失, 这对于研制新疫苗有理论指导意义。
2.3 基因芯片在兽药研究中的应用
基因芯片在兽药领域主要应用于检测兽药病原菌耐药性、药物筛选和新兽药研发。与传统的药物筛选相比, 基因芯片技术可分析用药前后机体不同组织、器官基因表达谱的变化, 高效筛选出新药物或先导化合物, 省略了大量动物试验, 缩短了药物筛选时间, 提高效率的同时降低了风险和费用, 促进了新兽药研发。在检测兽药病原菌耐药性方面, 林居纯等[12]利用寡核苷酸芯片对兽医临床常见病原菌耐药性检测进行研究。根据大肠杆菌、无乳链球菌、沙门氏菌和鸡毒支原体的gyr A基因序列制备的寡核苷酸芯片, 能同时检测不同病原菌gyr A第83、87位发生的突变, 芯片检测结果与测序结果相一致。
2.4 基因表达检测
由于基因芯片技术具有高通量、高并行性的特点, 所以被广泛应用于基因表达检测, 从而解决了传统方法1次只能研究1个基因表达情况的弊端。其原理是依靠短的寡核苷酸探针与DNA杂交, 利用杂交谱重建DNA序列。该技术为大规模测序提供了方便、快捷、准确的手段。田振军等[13]应用c DNA基因芯片对安静对照组和运动性心肌肥大组小鼠心肌组织的基因表达差异进行筛选, 结果证实具有显着性表达差异的基因有71个, 其中上调表达基因37个, 下调表达基因34个。
2.5 转基因动物产品检测与动物检疫
转基因食品在给人们带来前所未有的经济价值的同时, 也带来一些生物安全隐患, 在不确定外源基因的食用安全性及其次生效应安全性的情况下, 转基因食品的推广无疑是把双刃剑, 因此应加大转基因食品的检测力度。基因芯片是转基因食品检测最具潜力的手段之一。另外, 广泛收集用于转基因技术的目的基因启动子和标记基因的EST序列, 制成基因芯片, 可用于跨区域引种、调种及海关进出口动物检疫等。石丰运[14]通过对脊椎动物分子标记基因进行序列分析, 选择线粒体DNA (mt DNA) 16S rRNA基因为目标基因, 在1对通用引物扩增区间设计了16条特异性基因芯片检测探针对牛、山羊、绵羊、鹿、驴、猪、兔、鸡、鸭、鹅、鹤鹑、火鸡、鸵鸟、鱼等16种动物源性成分进行检测, 最终建立了这些动物源性成分基因芯片检测方法。
2.6 动物发病机制的研究
每种细胞在执行各自功能时, 表达的基因种类和数量以及表达的丰度都恰如其分。个别基因异常表达将会导致生理紊乱, 产生不正常的生理现象, 将会带来整个表达谱的失调从而导致疾病。因此, 可以用表达谱基因芯片检测病变组织细胞的基因表达变化情况, 了解疾病发生、发展、转归的相互联系, 从而明确疾病发生机制[15], 为诊断或寻找治疗靶位基因提供线索。
3 讨论
3.1基因芯片技术作为一项新诞生的技术, 在短时间内得到迅猛发展, 但要广泛应用于兽医临床尚有一些关键的技术问题需要解决。首先, 与动物疫病相关的微生物有几百种, 但目前被测序的仅仅有几十种, 致病微生物的基因组信息远远满足不了实际检测与诊断的需要, 从一定程度上阻碍了基因芯片技术在兽医临床中的应用。其次, 目前基因芯片的制做程序比较复杂, 成本较高, 尽管芯片或微阵列可以多次重复使用, 但每次杂交反应后, 其敏感性都要降低。最后, 在杂交反应中, DNA芯片上原位合成探针有可能有错误的核酸或杂质混入、杂交背景变得复杂、特异性会降低等问题。
3.2随着生物芯片技术的不断研究和进一步成熟, 其在兽医学研究领域将得到广泛应用。可以进行基因诊断、基因表达研究、基因组研究、发现新基因;病原体的诊断;筛选新药、鉴别假药;识别中药的有效成分, 促进中药现代化的实现等众多领域的研究。随着生命科学技术的不断发展, 计算机软件的进一步开发利用, 其成本较高、无法普及、待测的靶探针标记方法比较繁琐等问题一定会得到解决。基因芯片技术快速、同时准确地分析数以万计的基因组信号的能力, 在兽医学研究中必将成为有用手段, 为人类社会带来巨大效益。
参考文献
[1]沈关, 周汝麟.现代免疫学实验技术:第2版[M].武汉:湖北科学技术出版社, 2002.
[2]周灵君.基因芯片技术研究现状及展望[J].贵阳中医学院学报, 2006 (4) :50-52.
[3]宋振强, 王江辉, 薛双, 等.基因芯片在动物医学中的应用进展[J].郑州牧业工程高等专科学校学报, 2006, 26 (2) :21-22.
[4]王璐.基因芯片技术研究现状[J].医学动物防制, 2005, 21 (1) :3-6.
