药物经体内代谢通常会引起损伤，对乙酰氨基酚（扑热息痛）是乙酰苯胺类解热镇痛药，是医学临床常用的解热镇痛药物之一。其常规剂量用药安全可靠，但在大剂量应用则可引起动物和人严重肝肾损伤，甚至死亡[1-2].孙大庆等[3]指出残留的抗微生物药对人体可产生多种直接和间接危害，甚至免疫力降低过敏反应和细菌耐药性等毒害作用。可见了解药物代谢机制可为更好地合理用药提供依据。对乙酰氨基酚在体内主要由细胞色素 P450 酶家族成员CYP2E1 酶代谢，且可影响 CYP2E1 的酶活性[3],从而加重其对肝脏的损伤。目前都以活体动物为研究对象，通过检测血清及肝组织匀浆中肝功能指标的变化，来揭示肝损伤的程度。姚光弼等[5]研究证实对乙酰氨基酚可引起 GSH 含量降低，MDA 升高。因此实验通过检测肝损伤有关的六种酶来探索对乙酰氨基酚诱导大鼠急性肝损伤作用，也可为深入研究对乙酰氨基酚对 CYP2E1 的诱导作用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂
对乙酰氨基酚，批号：D1301026 购自 sigma 公司；谷草转氨酶（AST,批号：2013017）、谷丙转氨酶（ALT,批号：2013034）、碱性磷酸酶（ALP,批号：2013001）、超氧化物歧化酶（SOD,批号：20140311）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX,批号：20140312）、（丙二醛 MDA,批号：20140310）、总蛋白测定试剂盒（批号：20140319），均购自南京建成生物工程研究所。
1.1.2 实验动物
实验用雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠，180~220 g,购自吉林大学白求恩实验动物中心。
1.1.3 实验仪器
UV-8000 紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；JD100-3B 分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；以及电热恒温箱和离心机等。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及用药
取 SD 大鼠 60 只，随机分成 4 组，分别为对照组及对乙酰氨基酚低（75 mg·kg-1）、中（150 mg·kg-1）、高（250 mg·kg-1）剂量组，每组 15 只。采用皮下注射给药，对照组给予生理盐水，给药后 1、6、24 h,各组随机取 5 只大鼠，检测各项指标。
1.2.2 指标检测大鼠固定后，断头取血，置于含有抗凝剂的试管中，3 500 r·min-1离心 5 min,上清即为血浆，-20 ℃保存待检。同时，迅速剖取肝脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸湿后，称取湿重 0.3 g 左右，加入预冷的生理盐水，冰水中制成 10%匀浆，4 ℃ 6 000 r·min-1离心5 min,提取上清液，-20 ℃保存待检。其中 AST、ALT:2,4-二硝基苯肼法，ALP:磷酸苯二钠比色法，SOD:黄嘌呤氧化酶法，MDA:硫代巴比妥酸法（TBA），GSH:DTNB 改良比色法。所有酶的检测均按照试剂盒说明书方法操作。
1.2.3 数据处理实验的计量数据均以x軃±S 表示。采用 SPSS11.5统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多个样本均数之间的多重比较用 Post-Hoc LSD 法。
2 结果
2.1 血浆中 AST、ALT 和 ALP 的变化。
实验组大鼠血浆 AST 和 ALT 活性与对照组比较，中、高剂量组均明显升高，且高剂量组（P<0.01）差异极显着，中剂量组（P<0.05）差异显着，低剂量组无显着变化（见图 1 和图 2），说明中、高剂量组引起细胞损伤导致血浆转氨酶升高，且高剂量组比较严重引起急性损伤；ALP 活性与对照组比较，高剂量组24 h 显着降低（P<0.05），低、中剂量组先升高后趋于正常，说明 ALP 在药物剂量最大且作用时间最长时引起肝脏轻微胆汁淤积损伤（见图 3）。
2.2 肝组织中 SOD、GSH 和 MDA 的变化。
实验组大鼠肝组织的 SOD 活性与对照组相比总体都降低，高剂量组显着降低（P<0.05），中剂量组随时间延长而逐渐降低（P<0.05），低剂量组无显着变化（P>0.05）（见图 4）。GSH 含量与对照组比较，三个剂量组都降低，中、高剂量组差异极显着（P<0.01）；低剂量组差异显着（P<0.05），且随时间先降低后恢复正常（见图 5）。SOD 与 GSH 的显着降低，表明对乙酰氨基酚降低了机体抗氧化能力，从而引起肝组织氧化应激。故实验检测 MDA 含量来反映脂质过氧化损伤程度，其结果与对照组比较，中、高剂量组显着升高，差异极显着（P<0.01）或差异显着（P<0.05），低剂量组则无显着变化（P>0.05）（见图 6）。同时所测指标值见表 1、2、3（表中 A、B、C 分别代表低中高药物剂量组）。
3 讨论
对乙酰氨基酚进入体内经肝细胞色素 P450 酶代谢后，生成的毒性中间产物 N-乙酰苯醌亚胺（NAPQI），其与肝脏内还原型谷胱甘肽（GSH）结合，以无毒形式从尿中排出。但当对乙酰氨基酚剂量过大时，未被结合的 NAPQI 与肝细胞大分子共价结合，引起肝细胞坏死，细胞通透性增强，使转氨酶释放入血，从而造成血浆转氨酶升高[6].因此，检测血浆转氨酶可间接表明肝损伤程度。实验结果表明，对乙酰氨基酚中、高剂量组大鼠的 AST 和 ALT 值显着升高，表明肝细胞线粒体损伤严重。同时 ALP 值可体现胆汁淤滞性疾病程度[7],实验在 24 h 时，高剂量对乙酰氨基酚组大鼠 ALP 与对照组比较差异显着（P<0.05），说明高剂量药物作用时间最长时可引起大鼠轻度胆汁淤积。综上可得高剂量对乙酰氨基酚组引起肝细胞急性损伤。LIANG YL 等[8-9]报道对乙酰氨基酚在肝内代谢过程中产生的自由基可引起肝细胞膜脂质过氧化。
机体 SOD 可清除自由基，抑制自由基启动的脂质过氧化反应从而降低对机体损伤。GSH 能保护蛋白巯基不被氧化损伤，可与 SOD 共同消除超氧阴离子自由基，从而保护细胞内结构的稳定[10].可见检测肝组织这 3 种酶的变化可体现肝细胞受损程度。结果表明，高剂量对乙酰氨基酚组大鼠肝组织的 SOD 和GSH 值显着下降，说明机体抗氧化能力下降，而未被SOD 清除的、过量自由基引起了肝细胞脂质过氧化，发生了氧化肝损伤。而肝细胞受损和组织过氧化损伤还可增加 MDA 的含量。实验高剂量组大鼠的MDA 含量显着升高进一步证明高剂量对乙酰氨基酚组对大鼠肝脏的损伤作用。
综上所述，对乙酰氨基酚低剂量组大鼠可通过GSH 消耗而代谢毒物不引起肝损伤。中剂量组可引起大鼠轻微肝损伤。高剂量对乙酰氨基酚组可成功诱导大鼠急性肝损伤，且以 24 h 最为显着。因此，高剂量对乙酰氨基酚组可作为临床造模参考，为研究CYP2E1 的诱导机制奠定了实验基础。
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