藁苯内酯为当归、川芎等伞形科植物的特有活性成分，具有松弛平滑肌、改善微循环、镇痛及抑制平滑肌细胞增殖等作用，还能明显保护大鼠由于脑部缺血、前脑灌注不足及 β 样淀粉蛋白引起的脑部损伤，其可能的机制包括提高中枢胆碱能活性、抑制神经炎症反应及增强机体抗氧化和抗凋亡的能力。兴奋性毒性是指由于谷氨酸盐及其类似物等神经递质的过度产生而导致神经细胞的损伤及死亡的病变。许多急性或者慢性的神经性疾病( 包括中风和阿尔兹海默症) 都与神经元的兴奋性毒性有关。现研究藁苯内酯对由神经兴奋性毒素鹅膏蕈氨酸注入基底核大细胞内致大鼠神经行为学缺陷的影响和神经病理学的改变。
1、 实验部分
1． 1 仪器、试药与动物
Morris 水迷宫测试仪 ( 成都泰盟科技有限公司) 。藁苯内酯( LIG，香港理工大学，从当归的干燥根中提取分离和纯化，纯度 ＞99%，使用时用3% 吐温 80 配制) ; 鹅膏蕈氨酸( IBO，美国 Sigma) ; NSE、GFAP、TNF － α 多克隆抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ; OX －42 ( 英国 Abcam) 。♂Wistar 大鼠( SPF 级，重庆市腾鑫生物技术有限公司，合格证号:SYXK 2008 － 24) ，体重 250 ～ 300 g。
1． 2 方法与结果
1． 2． 1 动物的分组 将 40 只♂Wistar 大鼠随机均分为假手术组( sham) 、模型组( vehicle) 和 LIG 高( LIG10) 、低( LIG2． 5) 剂量组( 10、2． 5 mg·kg－ 1LIG) 。
1． 2． 2 IBO 损伤模型的建立及术后动物的处理参照文献的方法，制备大鼠 IBO 损伤模型。大鼠按 50 mg·kg－ 1ip 3% 戊巴比妥钠麻醉后，将其头固定在脑立体定向仪上。参照大鼠脑立体图谱，以前囟为基点，后移 0． 9 mm，旁开 2． 4 mm，以牙科钻钻开颅骨，用 5 μL 微量注射器垂直进针，向下 7. 5mm，缓慢将 1 μL 5 μg·μL－ 1IBO 注入大鼠双侧基底核大细胞( NBM) 内。假手术组大鼠 ip 等量生理盐水; LIG 高、低剂量组大鼠于术后 24 h 分别 ig 给予 10、2． 5 mg·kg－ 1LIG，每天 1 次; 模型组和假手术组大鼠则同时 ig 给予等体积 3% 吐温 － 80 溶液。给药第 15 天开始进行水迷宫测试。
1． 2． 3 水迷宫试验 参照 Morris 水迷宫测试方法，评价动物空间学习和记忆能力。测试包括隐匿平台试验: 共进行4 d，每天训练4 次，训练间隔时间60 s，记录大鼠在 90 s 内逃逸潜伏期; 探针试验: 水迷宫测试第 5 天撤除平台，从原平台象限对侧池壁的中点将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠 90 s 内在目标象限( 原平台所在象限) 停留的时间。在隐匿平台试验中，模型组大鼠的逃逸潜伏期较假手术组的明显延长( P ＜ 0． 01) ; LIG 低剂量组比模型组的逃逸潜伏期有所缩短，但并无显著性差异; LIG 高剂量组的逃逸潜伏期比模型组的明显缩短( P ＜0. 01) 。在探针实验中，模型组比假手术组的大鼠在目标象限( 原平台所在象限) 停留的时间明显缩短( P ＜0． 01) ; LIG 高剂量组与模型组的大鼠比较，目标象限停留的时间显著性增加( P ＜0. 01) 。表明LIG 对 IBO 诱导的 NBM 损伤大鼠的空间学习记忆损伤有明显的改善作用( 图 1) 。
1． 2． 4 免疫组织化学 探针试验结束后，将大鼠麻醉后开胸腔，剪开右心耳，从左心室灌注约 200 mLpH7． 4 PBS、约 100 mL 4% 多聚甲醛。快速开颅，取全脑、去除小脑、脑干及嗅球，置 10% 中性甲醛中固定 24 ～ 48 h，制作脑部冠状石蜡切片，进行病理检测。石蜡切片用 3% H2O2漂洗 15 min、用 5% 牛血清蛋白孵育 30 min 灭活内源性过氧化物酶。切片分别用不同的一抗进行孵育: NSE ( 1∶50) 、OX －42 ( 1 ∶100 ) 、GFAP ( 1 ∶ 100 ) 或 TNF － α ( 1 ∶100) ，于 4 ℃ 下过夜。滴加生物素化羊抗兔 / 小鼠IgG 后，于 37 ℃ 孵育 1 h，滴加 SABC，于 37 ℃ 孵育 1h，DAB 染色、苏木素轻度复染，常规脱水、二甲苯透明、中 性 树 胶 封 片。 以 Olympus － BX51microscope － DPTO － camera 图像系统观察并采图。
免疫组织化学染色结果的定量分析采用 Image － ProPlus 6． 0 软件。
1． 2． 5 IBO 诱导的神经元损伤的保护作用 NSE的表达被视作 IBO 对大脑损伤程度的判断指标。NSE 免疫组化结果显示: 模型组大鼠皮层的 NSE 阳性细胞数明显低于假手术组，用 LIG 高剂量治疗后NSE 阳性细胞数量增加。表明 LIG 对 IBO 诱导的神经元损伤具有保护作用( 图 2) 。
1． 2． 6 LIG 对 IBO 诱导的胶质细胞活化和神经炎症的抑制作用 在大鼠的基底核大细胞内注射 IBO后，用免疫染色的方法检测星形胶质细胞，小胶质细胞和炎性因子的病理学变化。结果显示: 模型组GFAP、OX － 42、TNF － α 的表达明显高于假手术组，而 LIG能够降低GFAP、OX － 42、TNF － α的表达，表明 LIG 能够抑制胶质细胞的活化和神经炎症的产生( 图 3) 。
1． 2． 7 统计分析 实验数据以珋x ± s 的方式表示，采用 SPSS16． 0 软件进行统计分析。水迷宫隐匿平台试验测试的结果采用重复测量数据的双因素方差分析( two － way AVONA) ，其他实验结果采用单因素方差分析( one － way AVONA) ，组间差异采用 posthoc LSD 检验。P ＜ 0． 05 为有显著性差异。
2、 讨论
神经毒素鹅膏蕈氨酸( IBO) 为 N － 甲基 － D －天冬氨酸( NMDA) 受体激动剂，激活 NMDA 受体后会引起一些神经行为的缺失和神经病理反应。用IBO 造成 NBM 损伤的大鼠通常被用作兴奋性毒性脑损伤的模型。文中观察到 IBO 注射到大鼠NBM 内可致认知能力受损和神经病理学改变，这与文献报道相符。在给予 IBO 20 d 后，与假手术组比较，模型组大鼠在水迷宫定位航行实验中的逃逸潜伏期明显变长; 探针实验中，在目标象限停留的时间明显缩短。从 NSE 免疫染色中可以看到: 模型组大鼠的神经元形态有显著改变，活细胞数目也明显减少。但在注射 IBO 后 24 h 时给予 10 mg·kg－ 1藁苯内酯( LIG) 就可显著改善大鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，并且使神经元的形态和数量都恢复到接近正常水平。小胶质细胞是中枢神经系统的一种免疫细胞，可以被多种病理因素活化。活化的小胶质细胞开始增殖并且产生多种炎性因子如 TNF －α，这些因子会导致神经元损伤，因此，胶质细胞病理性的活化会加重兴奋性毒性。文中结果显示:
相比假手术组，模型组大鼠出现了胶质细胞的异常活化( 如活化的小胶质细胞和星形胶质细胞) ，TNF － α 的表达量也上调，但是这些病理改变都可以被 LIG 显著抑制。实验结果提示: LIG 可能通过抑制胶质细胞的活化和后续的神经验证反应来缓解兴奋性脑损伤。
