单克隆抗体药耐药问题与应对策略研究(2)

Griffin 等[11]首次对细胞的削除机制进行了描述，他发现，即使没有调理细胞的吞噬和破坏作用，单核细胞或巨噬细胞也可以完成对的内化。其之前的研究也表明，抗原抗体复合物覆盖的细胞可以防止调理细胞的吞噬吸收（ 研究发现，被抗体有效覆盖一半的靶向细胞和效应细胞的细胞膜发生紧密接触） ,但不作用于调理抗体覆盖一半的靶向细胞远端的裸露部分，因此，防止了巨噬细胞“拉链”吞噬的发生。虽然这些数据很好地解释了抗体介导的这一过程，但是早期的研究证实，多克隆抗体较单克隆抗体的作用更大。这可能是因为多克隆抗体可以提高同受体（ B 细胞受体） 的结合，进而诱导产生超交联效应，如利妥昔单克隆抗体药物可以识别更离散的抗原，并形成较早期研究更小的“帽”.几个实验室的研究都显示出类似的结果，其他多种单克隆抗体（ 曲妥珠单克隆抗体药物，西妥昔单克隆抗体药物，T101,依帕珠单克隆抗体药物，达利珠单克隆抗体药物，CD22/CD20双特异性抗体和 CD3/TROP-2 双特异性抗体） 的削除机制发生在靶细胞上[12].
　　
　　建立适合不同细胞类型、设计合理的单克隆抗体，可以有效避免耐药性的产生。如： 选用Ⅱ型抗 CD20 单克隆抗体，如 obinutuzumab,或在注射rituximab 的同时，注射降低内化作用的单克隆抗体药物，以克服内化机制的影响。为了克服因抗原丢失造成的不利影响，有研究者提出多次低剂量注射抗体的用药策略，试图充分清除细胞，但没有成功，其建议对效应细胞进行浸润处理或使用其他直接靶向单克隆抗体，提高药物在 CLL 患者中的响应率。
　　
　　在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，利妥昔单克隆抗体药物的剂量递增试验对于 CLL 患者的有效率高于每周 1 次注射（ 剂量为 2 250 mg /m2）[10].此外，最近一项使用低剂量利妥昔单克隆抗体药物针对之前治疗无效的 CLL 患者的随机Ⅱ期临床试验中，因其效果低于标准方法 FCR,在实验早期即终止。表明实验中削除机制没有限制药物的有效性，低剂量利妥昔单克隆抗体药物不增加 CLL 患者的疗效，但是这些结果受米托蒽醌入的干扰。
　　
　　CD20 阴性细胞的出现是更大的问题，Taylor等[10]认为，其是解除抑制的循环细胞，或被效应细胞削除后逃脱免疫效应细胞作用的循环和传递细胞，或最终被清除的是上述某类细胞。Taylor等[10]认为，削除机制是一个次要而独立的过程，只有当效应细胞浸润或耗尽时，才对耐药循环细胞发挥作用[13].
　　
　　Boross 等[14]的研究支持后者的观点，清除的都是被削除的细胞，RTX 诱导的 CD20 吞噬作用依赖于 RTX 的浓度，并和 CD20 的疗效相关，两个过程是密切相关的。如果在体外使用乳胶珠，人工造成小鼠或人类巨噬细胞的饱和，削除机制中饱和相关的损失减少，相应的吞噬作用也下降。另外，Pedersen 等[15]的研究表明，抗 CD20 的Ⅰ型和Ⅱ型单克隆抗体都可能介导发生削除机制。尽管两者的削除机制类似，在体外和小鼠试验中，Ⅱ型单克隆抗体较Ⅰ型单克隆抗体介导的削除机制更强，这可能与Ⅱ型单克隆抗体缺少内化机制有关。最近，一项针对 CLL 患者的头对头临床试验中，Ⅱ型单克隆抗体 Obinutuzumab 和利妥昔单克隆抗体药物联合苯丁酸氮芥，使无进展生存期延长近 1 倍（ 尽管 obinutuzumab 剂量较高） .总之，在抑制Ⅰ型抗 CD20 单克隆抗体有效性的过程中，细胞内化作用较削除机制的影响更大。
　　
　　4 单克隆抗体和抑制性 FcγRIIB 的其他相互作用

       4. 1 靶细胞的顺式作用

       顺式作用是指单克隆抗体药物靶向特异细胞自身的表面受体 FcγRIIB发生的相互作用，并发生后续效应。首先，抗体和FcγRIIB 之间的顺式作用可以与反式细胞表达其他 FcγR 竞争，进而降低后续的 FcγR 依赖的免疫效应。有研究者使用肿瘤靶向治疗抗体对转染FcγRIIB 的黑色素瘤的小鼠进行治疗，结果显示，非转染 FcγRIIB 的黑色素瘤的小鼠比较，使用转染 FcγRIIB 的黑色素瘤的小鼠生存期明显缩短。体外实验证实，这种效应独立于 FcγRIIB 胞质结构域，具有较低的抗体依赖性的细胞毒作用。我们推测，FcγRIIB 和治疗性单克隆抗体间发生顺式作用，于反式专业吞噬细胞表达的活性 FcγR.通过加强 FcγR 活化，吞噬细胞可以作为辅助促进免疫反应，通过抗原提呈细胞降低吞噬细胞的摄取作用[16],同时，也减低了针对肿瘤特异抗原的抗原特异性免疫反应。
　　
　　FcγRIIB 和治疗性单克隆抗体间的顺式作用可能结合抗体的 Fc 片段，而与补体蛋白形成竞争。Ⅰ型抗 CD20 单克隆抗体与补体的高效作用，激活经典的补体级联反应，其对于体内的抗体治疗是不必要的。研究表明，通过反式的 FcγRIII 表达，补体成分 C1q 和 C3 抑制Ⅰ型抗 CD20 单克隆抗体激活 NK 细胞，从而减少 ADCC 效应。这可能是由于补体和 FcγR 对于 Fc 片段结合的竞争而形成的。虽然没有实验证明，但是类似情况发生在补体和顺式表达的 FcγRIIB 之间，这两种蛋白竞争结合治疗性单克隆抗体的 Fc 片段。因此，对于单克隆抗体治疗，补体激活具有重要意义，但是与 FcγRIIB 的顺式相互作用会影响治疗效果。
　　
　　4. 2 靶细胞的反式作用

      研究显示，靶向 B 细胞表面受体的单克隆抗体药物通过顺式和反式与FcγRIIB 结合。与反式吞噬细胞表达的 FcγRIIB的作用较直接靶向单克隆抗体药物的治疗效果差，可能是由于 Fc 上的结合位点和吞噬细胞的活化 FcγR 竞争，抑制了细胞活化，进而对 FcγRIIB产生了抑制作用。单克隆抗体药物引起 FcγR 活化和 FcγRIIB 抑制的比率称为活化抑制率，可以通过细胞 FcγR 的表达量和单克隆抗体药物 IgG的亚型进行检测。小鼠 IgG1 抑制 FcγRIIB 的结合能力高于 IgG2a,因此，小鼠 IgG1 药物的活化抑制率更低，药物的治疗效果差。Nimmerjahn 等[17]
　　
　　利用小鼠转移性黑色素瘤细胞系对单克隆抗体药物和 FcγRIIB 相互作用对药效的影响，以及活化抑制率的重要性进行了研究。利用直接靶向肿瘤的单克隆抗体药物、IgG2a 亚型单克隆抗体药物对小鼠进行治疗，这种药物的活化抑制率为 70,结果显示，相对于没有药物治疗的对照组动物，治疗组的肺转移率明显下降，几乎为零。相反，IgG1 亚型单克隆抗体药物活化抑制率较低（ 0. 1） ,IgG1 亚型单克隆抗体药物治疗的小鼠肺转移未减少。然而，将小鼠编码 FcγRIIB 的基因敲除，单克隆抗体药物只能和活性的 FcγR 结合，IgG1 亚型单克隆抗体药物的治疗效果明显增强。因此，单克隆抗体药物和 FcγRIIB 之间的反相结合将直接影响治疗效果。其机制与人类的多种肿瘤治疗有关，如：40% 恶 性 黑 色 素 瘤 的 转 移 性 肿 瘤 中 检 测 到FcγRIIB 的表达。肿瘤细胞自身（ 或相关非造血细胞） FcγRIIB 的异位表达，肿瘤细胞周围中效应细胞表达的活化 FcγR,和单克隆抗体药物形成竞争结合，降低了治疗性单抗活化抑制率和临床治疗效果。
　　
　　5 单克隆抗体耐药性的应对策略

      通过对抗 CD20 单克隆抗体药物的研究，我们认为，治疗性单克隆抗体药物和 FcγRIIB 的结合是导致单克隆抗体药物耐药的重要原因。Roghanian 等[15]联合使用 FcγRIIB 特异性封闭抗体6G11 和利妥昔单克隆抗体药物，对小鼠表达人 CD20 和 FcγRIIB 进行细胞实验。表明 FcγRIIB 特异性封闭抗体降低了体外实验中 B 细胞表面 CD20 的内化，提高了机体内 B 细胞的耗竭。此外，观察到类似的 B 细胞消耗增大，6G11 突变体 N297Q 与利妥昔单克隆抗体药物联合使用时，利妥昔单克隆抗体药物的Fc 片段无法与 FcγR 结合。这表明通过防止单克隆抗体药物在 FcγRIIB 和靶点间形成双极抗体桥接，减少了部分的利妥昔单克隆抗体药物介导的内化，进而增强治疗效果。
　　
　　除了抑制内化，阻断双极抗体桥接形成也能增加单克隆抗体和反式表达 FcγR 的相互作用。使用 FcγRIIB 阻断抗体，如6G11,也可以防止单克隆抗 体 药 物 与 反 式 的 吞 噬 细 胞 和 肿 瘤 细 胞FcγRIIB 的结合，进而提高活化抑制率，最终达到提高治疗效果的目的。
　　
　　实用药物与临床2017 年第20 卷第1 期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies,2017,Vol.20,No.1·111·治疗单克隆抗体药物同 6G11 联合使用的临床实验结果，值得期待。如果成功，阻断 FcγRIIB的单克隆抗体药物将可能用于多种靶向单克隆抗体药物的联合治疗。抗 FcγRIIB 的单克隆抗体药物可以阻断下游抑制性信号通路，增加靶向单克隆抗体药物的治疗效果。然而，有研究表明，反向表达的 FcγRIIB 的交叉连接对于某些单克隆抗体药物（ 如抗 CD40 的药物） 是必须的，阻断 FcγRIIB 不利于单克隆抗体药物发挥作用，因此，在使用这种方法之前需要对抗体发挥作用的机制进行评估。
　　
　　6 结论

      单克隆抗体药物已经改变疾病治疗的方式，尤其是在肿瘤领域。自 1997 年利妥昔单克隆抗体药物上市，已有大量单克隆抗体药物进入临床。这种治疗不同于常规的化疗，其耐药机制也有所不同。我们对内化机制、消除机制以及 FcγRIIB介导的其他耐药机制进行了介绍，特别是抗 CD20单克隆抗体药物的耐药机制的研究进展。如果克服抗体耐药的策略行之有效，将为抗体的临床治疗提供更广阔的前景。
　　
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