随着我国养猪业向集约化、现代化方向发展,猪 群之间相互接触的几率大大增加,给疾病传播创造了大量的机会。多病原混合感染给疾病的防控带来很大的困难,要想从根源上防控疾病传播,需要建立一种快速、准确的诊断方法用于病原体的检测。
采用常规病毒分离诊断方法虽然准确,但费时费力,并且对人员的要求较高。多重PCR(multiplex pol-ymerase chain reaction,mPCR)是在常规PCR基础上发展起来的新技术,在同一个反应体系中加入2对或2对以上引物,分别扩增不同病原微生物的模板,可获得不同的目的片段,这种方法既保留了常规PCR方法的特异性和敏感性,又减少了操作步骤及试剂用量,可以在同一反应中检测多种病原微生物的特异基因,同时检测鉴别出多种病原体,无论在致病微生物引起的传染病诊断方面,还是在环境中致病微生物的检验领域,mPCR技术都具有较广阔的应用前景。在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值。猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)既和猪繁殖障碍和呼吸道疾病有关,又和猪免疫抑制性疾病相关,它们都可以不同程度地损伤机体的免疫功能,降低机体对外界的抵抗能力,为继发或并发其他病原微生物创造了条件,这可能也是混合感染多发的原因。本研究拟建立一种能够同时检测PCV2、PRV、PRRSV的mPCR方法,以期对临床样品进行早期、快速、准确的诊断,为猪病的防制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病毒和细胞PCV2、PRV、PRRSV和PK-15细胞、Marc-145细胞均由沈阳出入境检验检疫局检验检疫局保存。
1.2 主要试剂克隆宿主菌TP10、蛋白酶K购自天根生物工程有限公司。
TRIzol试剂、Taq DNA聚 合 酶、RNase Inhibitor、dNTP、DL2000 DNAMarker、AMV反转录酶、pMD18-T载体DNA提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司;胶回收(小量)试剂盒购自杭州爱思进生物科技有限公司;无水乙醇等分析试剂均为国产分析纯。
1.3 引 物 设 计参 照GenBank登 录 的PCV2、PRV、PRRSV基因组序列,查阅相关文献,借助Oligo 6.0引物设计软件,设计3对特异引物,用于扩增PCV2、PRV、PRRSV目的基因片段,引物的序列见表1。引物由大连宝生物工程有限公司合成,用双蒸水稀释为20mmol/L,-20℃保存备用。
1.4 临床样品收集收集来自辽宁省的30份猪呼吸道综合征肺脏样品,吉林省50份保育仔猪脾脏和淋巴结样品,黑龙江省40份断奶仔猪脾脏和淋巴结样品,山东省50份猪流产胎儿样品,福建省30份保育猪病料。所有样品均提取DNA和RNA,用于多重PCR和单一病毒PCR临床样品的检测。
1.5 样品DNA和总RNA的提取将临床样品利用DNA提取试剂盒(按照天根生化科技有限责任公司生产的DNA提取试剂盒说明书进行)和RNA提取试剂盒(按照杭州爱思进有限责任公司生产的DNA提取试剂盒说明书进行)进行核酸提取。将提取的DNA和总RNA于-80℃保存。
1.6 RT-PCR反应逆转录反应在20μL体系中进行,包括提取 样品 总RNA 5μL,反转 录溶液 [50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、75 mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT]4μL、dNTP 6μL、50pmol/L PRRSV反转录引物1μL、AMV反转录酶(200U/μL)1μL和RNA酶抑制剂(40U/μL)1μL,用DEPC水补足至20μL,42℃水浴1h,70℃5min。将反转录的cDNA于-20℃保存。
1.7 PCV2、PRV、PRRSV的PCR扩 增PCV2、PRV、PRRSV的PCR反应在25μL体系中进行,包括10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP 2μL,20pmol/L的PCV2、PRV、PRRSV特 异 性 引 物 各1μL,TaqTMDNA聚 合 酶1U,DNA或cDNA模 板 各1μL。反应程序:94℃5min;94℃45s,55℃(PCV2、PRRSV、PRV)1min,72℃1min,最后72℃延伸10min。取10μL PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.8 mPCR反应条件的优化及mPCR对mPCR反应条件,包括退火温度(45~58℃),引物浓度(5~20μmol/L),Mg2+浓度(1.5~500mmol/L),dNTP浓度(150~500μmol/L),TaqTMDNA聚合酶浓度(0.5~4U),反应体积(25~40μL)进行优化,以确定最佳反应条件。
mPCR反应在50μL反应体系中进行,包括30mmol/L MgCl22.5μL,10×PCR缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/L Tris-HCl,pH 8.3)4μL,2.5mmol/L dNTP 4μL;10pmol/L的 特 异 引 物 各0.5μL,TaqTMDNA聚合酶1.5U,PRV、PCV2、PRRSV DNA或cDNA各1μL,用双蒸水补足至50μL。反应条件为:94℃5min;94℃1min,55℃30s,72℃1min,35个循环;最后72℃延伸10min。取10μL PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
1.9 mPCR的敏感性试验mPCR反应及每种病毒PCR反应的敏感性参照文献的方法进行。将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后,用双蒸水做5倍系列稀释,取每个稀释度的病毒模板进行mPCR反应,同时将经10倍系列稀释的病毒核酸用于单病毒的PCR反应。
1.10 mPCR的特异性试验以猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、大肠杆菌(E.coli)为模板分别进行mPCR反应。
1.11阳 性 样 品 的mPCR检 测将 已 知 含 有PCV2、PRV、PRRSV的阳性病料,提取病毒核酸,分别进行PCV2、PRV、PRRSV的mPCR反应,PCV2、PRV多重PCR反应、PCV2、PRRSV多重PCR反应以及PRV、PRRSV的mPCR反应,每个反应重复进行3次。
1.12 mPCR对临床样品的检测对来自吉林、辽宁、黑龙江共200份临床样品进行mPCR检测,并且与各自的单PCR同时对这些样品进行重复检测,每个样品均重复检测3次。
2 结果
2.1 PCR产物的鉴定
PCV2、PRV、PRRSV的PCR扩增片段经胶回收连接到pMD18-T载体上,经TP10转化后,送大连宝生物工程有限公司测序,结果表明,扩增片段分别为各自病毒的特异性条带如图1所示。
2.2 敏感性试验
在mPCR反应中,各种病毒的最低检测量分别为32.5pg(PRV)、25.2pg(PCV2)、35.9pg(PRRSV)(图2)。在单一病毒的PCR反应中,各病毒的最低检测量分别为1.0pg(PCV2)、3.2pg(PRV)、2.5pg(PRRSV)(图3)。
2.3 特 异 性 试 验
CSFV、SIV、PCV1、BVDV、PPV、E.coli均 未 扩 增 出 条 带,而PCV2、PRV、PRRSV均扩增出各自病毒的特异性条带(图4)。
2.4 阳性样品的mPCR检测
各病毒的特异性引物均能很好地扩增出各自病毒的特异性目的条带(图5)。
2.5 mPCR对临床样品的检测
PCV2感染率为80%(160/200),PRV感 染 率 为21%(42/200),PRRSV的感染率为78%(156/200)。200份临床样品主 要 为PCV2和PRRSV混 合 感 染,阳 性 率 达56.0%(112/200);此 外,有14份 样 品 为PRV和PRRSV混合感染,阳性率为7%(14/200)(表2)【表2】
3 讨论
本研究建立的mPCR诊断方法能够对临床样品中PCV2、PRV、PRRSV单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定,结果表明,该诊断方法敏感性好、特异性高,具有广阔的应用前景。
在mPCR反应中,引物的设计至关重要,它决定着mPCR反应的成功与否。本研究设计的引物是针对3种猪病病毒各自相对保守的基因序列的,它们分别是PCV2ORF2基因、PRV gB基因、PRRSV N基因,这些基因具有高度的保守性,因此能够用作PCR扩增的目的基因。在这3种病毒中,由于PRV属于疱疹病毒科,其(G+C)含量较高,达73%,因此,在设计引物时,将扩增PCV2、PRV、PRRSV这4对引物的(G+C)含量控制在45%~60%,这样能确保所有的引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增,为成功进行多重PCR反应奠定了基础。
另一方面,在考虑退火温度时,将退火温度调整为55℃,能让病毒各自的目的条带都得到很好的扩增,结果表明,多重PCR均能够得到很好的扩增,同时避免了引物间的非特异性扩增。建立一种多重PCR诊断方 法 不 是 件 容 易 的 事 情,需 要 对 引 物 浓 度、Mg2+浓度、dNTP浓度等反应条件进行优化,以确定最 佳 反 应 条 件,从 而 建 立 起 检 测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR反应。在对多重PCR敏感性进行分析时,为了更准确地测定多重PCR反应的敏感性,病毒核酸经5倍系列稀释进行多重PCR反应,以测定其核酸最低检测量。同时,将单一病毒PCR的敏感性与病毒多重PCR的敏感性进行对比,结果表明,多重PCR的最低核酸检测量与单一病毒的最低核酸检测量相比,均相应减少了101~102个数量级,但仍然具有很强的敏感性,达到了pg级,结果表明,建立的mPCR反应具有很好的敏感性。通过对临床样品进行检测,可以看出,PCV2在猪场中存在普遍感染,这与PCV2的血清学流行病学调查结果相一致。此外,PCV2和PRRSV在保育猪中的检出率很高,并且混合感染现象相当严重,这应成为今后猪病防制的重点。
近年来,随着规模化养猪的不断发展,PCV2、PRV、PRRSV对养猪业造成的危害正日益加剧。本研究建立的PCV2、PRV、PRRSV多重PCR诊断方法能够快速、准确地对这3种病毒的临床感染样品进行检测,为病原体的诊断提供了一种新的方法。【图略】
