猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)引起的一种以母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等,仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为特征的传染病。
PRRSV是动脉炎病毒属(ar-terivirus)的成员,为单股正链RNA,约为15kb,共9个开放阅读框(ORF),分别编码2个非结构蛋白和7个结构蛋白。基因变异分布于整个基因组,尤其是NSP2和ORF5基因变异最大,常常作为病毒遗传变异和进化分析的靶基因。目前PRRSV主要包 括 以VR2332毒 株 为 代 表 的 美 洲 型 和 以Lelystad virus(LV)为代表的欧洲型2种基因型,我国大陆流行的病毒株主要为美洲型PRRSV。该病于1987年首次在美国发现,现已呈世界性分布。我国于1996年首次报道该病毒存在,随后流行于全国。自2006年夏秋季我国多个省份猪群暴发以高热、厌食、呼吸困难、高发病率和高病死率等为特征的“猪高热综合征”以来,陆续有文献证实该病是由PRRSV变异毒株———NSP2缺失30个氨基酸的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)引起的。本研究主要对2012―2013年采自河南各地的54份PRRSV疑 似 病 料 进 行 核 酸 检 测 及PRRSV分离,并对阳性样品的NSP2和GP5基因进行序列扩增与分析,研究河南地区PRRSV流行株NSP2和GP5基因变异情况和发展趋势,了解河南地区PRRSV的多样性,为河南地区PRRS的防制提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 病料采集
采集河南省郑州、洛阳、鹤壁、新乡、焦作、济源等地共54份疑似PRRSV阳性病猪的脾脏、肺脏、淋巴结等脏器。
1.2 主要试剂Taq DNA聚合酶、鼠源反转录酶(M-MLV)、RNA酶 抑 制 剂 (Rnase Inhibitor)、dNTP、pMD18-T载体均购自大连宝生物工程有限公司,Trizol Reagent购自Invitrogen公司,DEPC购自Amresco公司,琼脂糖购自Sigma公司,Marc-145细胞为本实验室保存,胎牛血清购自北京四季青公司。
1.3 引物设计参考PRRSV CH-1a株(GenBank登录号AF132118)和JXA1株 (GenBank登 录 号EF112445)全基因序列应用Primer5.0软件分别设计针对GP5基因和NSP2高变区的特异性引物(表1),引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。【表1】
1.4 病毒的分离与鉴定将采集的阳性病料经研磨、离心、过滤,接种于Marc-145细胞上培养3~5d,每天观察有无细胞病变(CPE)产生。将有病变的毒株传3~4代后用特异性PRRSV ORF5引物进行RT-PCR检测,同时利用PRRSV CH-1a株的GP5特异性单抗通过间接免疫荧光方法进行鉴定。将未出现CPE者,经冻融3次后盲传3~5代,有病变者按上述方法鉴定。
1.5 RNA的提取取病猪肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本,用PBS进行稀释后研磨,冻融3次,8 000r/min离心10min后,取上清参照Trizol reagent说明书进 行 操 作,所 提 取 基 因 组RNA用30μL 1‰DEPC水溶解,-70℃保存备用。
1.6 PRRSV NSP2基因和GP5基因的RT-PCR扩增提取上述部分阳性样品中的总RNA,首先以20μL体系反转录:RNA模板13μL,5×Buffer 4μL,dNTP(10mol/mL)1μL,随机引物1μL(20μmol/L),RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL,反转录酶M-MLV(200U/L)0.5μL。反应条件:42℃1h,95℃5min,得到的cDNA用于PCR扩增。
PCR按50μL反 应 体 系:10×Buffer 5μL,MgCl2(25 mol/mL)5μL,反转录产物(cDNA)5μL,dNTP(10mol/mL)1μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,上下游引物各1μL,补加灭菌双蒸水至50μL。
反应循环参数:95℃5min;95℃1min,56℃1min,72℃1.5min,共32个循环;最后72℃ 10min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.7 PCR产物的克隆与测序分别将上述NSP2基因和ORF5基 因 扩 增 产 物 回 收 纯 化 后 克 隆 入pMD18-T载体,取PCR和酶切鉴定为阳性的克隆送北京华大基因公司测序,每个样本重复测序2次。
1.8 NSP2基因和ORF5基因的序列分析利用DNAStar中的MegAlign对17株PRRSV河南毒株及参考毒株(表2)的NSP2基因和ORF5基因进行序列比对和同源性分析,利用MEGA4.0中的邻接法(neighbor-joining;bootstrap values of 1000repli-cates)对NSP2基因和ORF5基因进行遗传进化分析。【表2略】
2 结果
2.1 病毒分离将处理好的病料接种于铺满单层的Marc-145上,2~3d可见病变细胞发生堆积现象(图1)。将该毒连续传3~4代,通过RT-PCR可扩增出PRRSV的ORF5基因;利用PRRSV GP5单抗进行间接免疫荧光试验,能够在感染的细胞胞浆内观察到特异性荧光。结果在17份阳性病料中共分离到3株PRRSV,分 别 命 名 为HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3。
2.2 RT-PCR检测PRRSV结果对2012—2013年采 自河南各地的54份PRRSV疑似病料 进 行PRRSV RT-PCR检测,结果检出PRRSV阳性样品17份,阳性率为31.5%。
2.3 NSP2基因和ORF5基因序列的扩增和测定对17份阳性样本分别提取RNA,进行RT-PCR扩增,扩增产物连接入pMDl8-T载体,筛选阳性重组质粒并测序,NSP2扩增片段长度为1 124~1 513bp,ORF5扩增片段长度为864bp。基因序列均录入GenBank数据库(表2)。
2.4 NSP2基因的核苷酸序列分析 测序结果显示:同国内外相关毒株比较,17株毒株之间NSP2序列相似性为62.3%~98.9%,与美洲型毒株BJ-4、JXA1等的NSP2序列相似性为61.9%~99.5%,与欧洲毒株Lelystad virus的NSP2序列相似性为41.7%~45.0%,表明这些毒株均属于美洲型。其中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株与HP-PRRSV中国毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,序列相似度为95.5%~99.2%,且HENAU-QBS-6株在451~452和520~521之间分别插入了2个和1个碱基,剩余9株除个别碱基发生替换外,NSP2缺失情况一致,均有2个部位出现缺失,分别有编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码27个氨基酸的连续87个核苷酸缺 失;HENAU-QBS-4、HENAN-XINX-3株与VR2332、S1等经典毒株高度同源,序列相似度为98.6% ~99.5%,仅 在 个 别 碱 基 上 发 生 了 替 换;HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-HEB、HENAN-JIAOZ株与国外NADC30、MN184C等毒株高度相似,序列相似度为79.3%~95.2%,与高致病性及经典PRRSV均相差较 远,序 列 相 似 度 分 别 为63.7% ~74.5%和67.0%~69.1%。缺失部位和数量也有所不同,即在975~1 307、1 452~1 454、1 515~1 571位共缺失393个核苷酸。这是在2006年美国出现NSP2基因缺失393个核苷酸以来,国内首次出现核苷酸缺失数量如此之多的毒株。
2.5 NSP2基 因 的 氨 基 酸 同 源 性 分 析17株PRRSV之间的氨基酸同源性为59.7%~98.7%。其 中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株与HP-PRRSV中国毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,氨基酸相似度为88%~99.2%;HENAU-QBS-4、HENAN-XINX-3株与经典PRRSV VR2332、S1毒 株 氨 基 酸 相 似 度 为97.8% ~99.2%;而HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株与 经 典PRRSV毒 株 和HP-PRRSV毒株差异均较大,与国外毒株NADC30等同源性较高,相似度为81.3%~91.4%,且5毒株的氨基酸缺失部位和数量与以往的HP-PRRSV或其他变异毒株以及经典毒株都有很大不同,在323~433、482、501~519位共缺失131个氨基酸。这种缺失在美国(2006年)和韩国(2012年)相继发现,但在国内尚属首次。
2.6 基于NSP2部分序列的PRRSV遗传进化分析基于NSP2部分序列的PRRSV遗传进化分析显示,美洲型PRRSV可以分为3个亚群(图2),即以HP-PRRSV JXA1、HuN4等为代表的亚群1,以经典 毒S1、VR2332为 代 表 的 亚 群2,以 及 以NADC30、MN184C等为代表的亚群3。而17株河南地 区PRRSV毒 株 中 有10株 (NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF)属于亚群1,2株(HENAU-QBS-4、HENAN-XINX-3)属于亚群2,另外5株(HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-HEB、HENAN-JIAOZ)则属于亚群3。由此可见,近两年河南省流行的PRRSV仍以NSP2存在30个不连续氨基酸缺失为特点的HP-PRRSV为主,在有经典毒株存在的同时又不断有新的变异毒株出现。
2.7 ORF5基因的核苷酸序列分析 基于ORF5基因的核苷酸序列分析显示,17株PRRSV河南毒株之间ORF5基因序列相似性为84.4%~99.5%,同VR2332、JXA1等美洲型参考毒株的ORF5基因序列相似性为82.8%~99.5%,同欧洲型参考毒株Lelystad virus的ORF5基因序列相似性为62.1%~64.6%。 其 中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株与HP-PRRSV中国毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,序列相似 度 为94.5% ~99.5%;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株与经典毒株VR2332、S1高度同源,相 似 度 为98.8% ~99.5%;HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB、HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2与 国 外 毒 株MN184c,NADC30等高度同源,序列相似度为89.6%~95.0%。17株毒株除有数量不等碱基替换外,未出现碱基的插入和缺失。
2.8 ORF5基因推导的氨基酸同源性分析 17株PRRSV之间的氨基酸同源性为84.1%~99.5%。
其 中NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF株与HP-PRRSV中国毒株JXA1、HuN4、TJ等 高 度 同 源,氨 基 酸 相 似 度 为94.5%~99.5%;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株与PRRSV经典毒株BJ-4、VR2332、S1等氨基酸相似度为97.5%~99.5%。而HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株 与 经 典PRRSV毒 株 和HP-PRRSV毒 株 差 异 均 较 大,与 国 外 毒 株NADC30、MN184c等同源性较高,相似度为89.6%~99.0%,表明国内出现了新的变异毒株。
2.9 ORF5基因推导的氨基酸序列比对分析利用DNAStar等软件进行氨基酸序列比对发现,17株河南PRRSV毒株的GP5蛋白存在多处氨基酸突变,高变区主要集中在糖基化位点区域和中和表位(37~44位氨基酸)及诱骗表位(27~30位氨基酸)。
美洲型PRRSV GP5蛋白糖基化位点一般为3~5个,根据N-糖基化位点分析结果,糖基化位点在数目上,经典毒株4个,高致病性毒株为4~5个,新变异毒株 为3~5个。在 中 和 表 位 和 诱 骗 表 位 中,HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOY、HENAN-LUOH、HENAN-KAIF、HENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6株与HP-PRRSV一致,L39突变为I39;HENAN-JIAO-Z、NENAN-JIY、HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6株与 中 国 的 一 些 经 典 毒 株 和 全 部 的HP-PRRSV一 样,发 生 了A29V的 突 变。在PRRSVGP5的毒力相关位点(第13位和第151位氨基酸)处,与 经 典 毒 株 高 度 同 源 的HENAN-XINX-3、HENAUQ-BS-4株及出现的新变异株HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株的第13位氨基酸均发生R13→Q13的突变;其余与HP-PRRSV高度同源的毒株则一致,与返强毒株VR2332相同,即R13,R151。
2.10 基于ORF5序列的PRRSV遗传进化分析基于ORF5基因核苷酸序列的遗传进化分析显示,美 洲 型PRRSV可 以 分 为3个 亚 群 (图3)。
HENAN-LUOY、HENAN-KAIF、HENAN-ZHENGZ、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6株 同HP-PRRSV TJ、HuN4、JXA1株组成亚群1;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株与经典毒株VR2332、S1、BJ-4组 成 亚 群2;HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB、HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2株与2007年美国毒株MN184c和2012年美国毒株NADC30等同属于亚群3。国内毒株首次出现在亚群3中,预示着国内出现了新的PRRSV毒株,应当给予一定的关注。
3 讨论
从1996年首次证实PRRSV在我国存在,到2006年夏秋季节,高致病性蓝耳病在我国南方部分地区开始暴发,HP-PRRSV近些年在我国大部分地区流行,PRRSV在我国先后经历了传播、变异、暴发、再变异、流行等不断变化的过程。研究表明,同一基因型的分离毒株之间存在明显的序列差异,特别是在基因组ORF1a的NSP1β和NSP2,ORF3和ORF5的变异性较大。病毒在猪体内持续感染过程中,会出现不同的亚群,近些年,由于弱毒活疫苗的使用,在选择压的作用下弱毒活疫苗发生返强突变,从而造成PRRS的暴发。目前我国PRRSV流行 情 况 比 较 复 杂,以 广 泛 流 行 的 美 洲 型HP-PRRSV为主型,经典毒株和其他变异毒株也时有出现,同时偶有欧洲毒株存在的相关报道。
PRRSV未来如何衍变,致病性如何发展等均值得我们高度关注,因此有必要对其流行情况及相关基因型的进化进行监测。
NSP2是经历显着遗传变异的PRRSV基因组中突变率最高的部分,其在同一基因型中和各基因型之间变异都很大。同为美洲型的HB-2株、BJ-4株、VR2332株和CH-1a株,其NSP2的氨基酸同源性为78.3%~88.9%。同时,其具有很高的耐缺失或插入的能力,如MN184的NSP2缺失了100多个氨基酸,sp184212株的NSP2插入了30多个氨基酸,而HP-PRRSV共同缺失了30个不连续的氨基 酸。此 外,由 于NSP2的 蛋 白 酶 活 性,使NSP2编码区可能在病毒复制和调节宿主免疫方面具有至关重要的作用。因此,NSP2可以作为监测PRRSV变异的独特标记,用于对PRRSV进行分子流行病学分析。GP5蛋白是病毒粒子表面主要的囊膜蛋白之一,该蛋白不仅是PRRSV的重要免疫原性蛋白,含有重要的中和抗原表位和诱骗表位,而且是PRRSV的一个最多样性的结构蛋白,使得ORF5已经成为分析PRRSV遗传多样性的靶基因。因此,在研究NSP2的缺失和突变的同时,GP5的遗传多样性也受到了很高的关注。
本研究通过对2012―2013年间收集自河南的54份PRRSV疑似样品进行PRRSV RT-PCR检测,共 检 出PRRSV阳 性 样 品17份,阳 性 率 为31.5%。为研究中国河南地区PRRSV毒株基因变异及 分 子 流 行 病 学 情 况,本 研 究 对 其 中17株PRRSV阳性样品的ORF5全基因和NSP2部分基因序列进行了序列测定与分析。
NSP2基因序列分析结果显示,17份检样与PRRSV美洲型代表毒株序列相似性为63.9%~99.2%,与PRRSV欧洲型代表毒株序列相似性为41.3%~44.1%,说明17株PRRSV均为美洲型PRRSV。
ORF5的遗传进化分析可以将河南地区美洲型PRRSV分为3个亚群,即以JXA1、TJ等为代表的HP-PRRSV为亚群1,以VR2332、S1等经典毒株为代表的亚群2,以及以NADC30、MN184c等为代表的亚群3;且由氨基酸推导的结果发现,亚群2中所有的39位点都发生L39-I39的突变。亚群1和亚群3均为L39,该点的突变将会影响中和抗体的结合。研究表明N-多糖对病毒糖蛋白的折叠和功能具有重要的作用,糖基化位点的突变可能会影响病毒颗粒的产生和病毒的感染性。通过对17株河南毒株GP5的N-糖基化位点进行预测发现,亚群1含有4~5个糖基化位点,亚群2含有3~5个,亚群3则含有4个糖基化位点,说明河南地区美洲型PRRSV表面有3~5个糖基化位点。亚群1和亚群2中的毒株可能通过糖基化位点的位置和数目上的变化影响中和抗体与相应整合抗原位点的结合以及病毒对宿主细胞的侵染力,从而进行免疫逃避。
综合两基因的核苷酸与氨基酸同源性及遗传进化分析结果发现:NENAN-JIY、HENAU-QBS-1、HENAU-QBS-2、HENAU-QBS-3、HENAU-QBS-5、HENAU-QBS-6、HENAN-ZHENGZ、HENAN-LUOH、HENAN-LUOY、HENAN-KAIF等10株样品与HP-PRRSV中国毒株JXA1、HuN4、TJ等高度同源,在进化树中均位于亚群1中,这些毒株很可能起源于早期HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4等;HENAN-XINX-3、HENAU-QBS-4株与经典毒株高度同源,在进化树中均位于经典毒株S1、BJ-4、VR2332为代表的亚群2中,提示河南省猪 群 中 依 然 存 在 不 断 进 化 的 经 典PRRSV;HENAN-XINX、HENAN-XINX-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIAOZ、HENAN-HEB株与国外NADC30、MN184C等高度同源,与经典的PRRSV毒株相比存在较大的基因缺失,同时基因缺失部位和缺失的核苷酸数量又与HP-PRRSV明显不同,在进化树中均位于美国NADC30、MN184c等毒株为代表的亚群3中,目前为止该基因型毒株在国内尚未见相关报道,表明我国出现了新的PRRSV基因缺失变异毒株。由上可知,近两年HP-PRRSV依然是河南地区的优势流行毒株,且在有经典毒株存在的同时又不断有新的变异毒株的出现,这些新变异毒株的存在很可能是跨地区传播的结果,且有可能与引种有关,但具体来源有待进一步研究,其对我国养猪业的影响和PRRS的防制方面应给予一定的关注。
本研究中采集的病料大多来自于使用PRRSV经典毒株活苗进行免疫的猪场,近年来也有少部分猪场使用HP-PRRSV的致弱活苗和灭活苗,但是对HP-PRRSV防制效果没有对经典毒株的防治效果好。通过对新PRRSV缺失毒株所在猪场持续检测,我们发现猪场使用了PRRSV弱毒活疫苗后,虽然经 典 毒 株 和HP-PRRSV检 出 率 很 低,但 是 新PRRSV缺失毒株检出率却很高,说明目前市场的疫苗依然不能很好地控制蓝耳病的发生,PRRSV在不断的发生变异,新的PRRSV也在不断出现,其对我国养猪业发展的影响如何,应当引起高度的关注。【图略】
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