水泡性口炎病毒 (vesicular stomatitis virus,VSV)属于弹状病毒科水泡病毒属,可引起多种哺乳动物发生急性、高度接触性传染病(殷震等,1997),以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水泡为主要特征(侯云德,1990)。由于VSV呈嗜上皮性,一般认为,VSV的致病机理是病毒通过表面突起的糖蛋白与上皮或黏膜表面细胞受体结合而侵入机体的。
VSV可感染犊牛口腔黏膜上皮细胞,能产生典型的细胞病变效应(CPE),因此推测在犊牛口腔黏膜上皮细胞膜表面应存在VSV受体。
本试验主要研究VSV在犊牛口腔黏膜上皮细胞膜上的受体,通过采用T7噬菌体展示技术构建犊牛口腔黏膜上皮细胞噬菌体展示文库,为进一步筛选和鉴定VSV受体奠定基础。
噬菌体展示技术 (phage display techniques,PDT)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达。噬菌体展示技术是近年来建立和发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术(闫守庆等,2003),主要应用于蛋白相互作用,如抗体、酶类、细胞表面受体等 (Danner等,2011;Petra等,2001)。本试验利用T7噬菌体展示系统构建了犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库,为进一步筛选VSV受体奠定基础。
1、材料与方法
1.1材料
犊牛口腔黏膜上皮细胞由吉林大学畜牧兽医学院基础实验室培养。
Trizol试剂购自In-vitrogen公司;PolyATract mRNA Isolation Kit购自Promega公司;Orient Express Random Primer cD-NA Synthesis Kit、Mini Column Fractionation Kit和T7Select 10-3bCloning Kit均购自Novagen公司。
1.2方法
1.2.1总RNA的提取与mRNA的分离纯化收集足量生长状态良好的犊牛口腔黏膜上皮细胞,加入Trizol试剂提取总RNA,氯仿分离有机相,异丙醇沉淀RNA,75%乙醇洗涤沉淀,干燥RNA沉淀约5min,加250μL无RNA酶的水溶解;取2μL测定浓度和纯度,3μL用于1%琼脂糖凝胶电泳,其余 的 总RNA直接用于分离mRNA。 按 照PolyATract mRNA Isolation Kit说明书分离纯化mRNA,用紫外分光光度法测定mRNA浓度,用1%琼脂糖凝胶电泳检测mRNA质量。
1.2.2 cDNA的合成及末端平端化按OrientExpress Random Primer cDNA Synthesis Kit说明书合成双链cDNA(图1)。cDNA第1链的合成:取4.5μg mRNA作为模板,加入1μg随机引物,在M-MLV反转录酶作用下完成第1链的合成。
cD-NA第2链的合成:在第1链反应体系中加入1.6URNase H,使cDNA-mRNA杂合体上的mRNA链产生缺口,再加入50UDNA连接酶Ⅰ,合成cDNA第2链。取双链cDNA 20μL,加入115UT4DNA连接酶,利用T4DNA连接酶补平双链cDNA的末端。
1.2.3 cDNA与EcoR Ⅰ/Hind Ⅲlinker的连接及linker的消化取末端补平的双链cDNA10μL,加入2μL EcoR Ⅰ/Hind Ⅲlinker,在T4DNA连接酶作用下在cDNA末端连接上定向EcoR Ⅰ/Hind Ⅲlinker。然后分别加入EcoR Ⅰ和HindⅢ各100U消化linker,得到2端分别带有EcoR Ⅰ和HindⅢ黏性末端的双链cDNA。
1.2.4 cDNA片段的分级分离按Mini ColumnFractionation Kit说明书进行双链cDNA分级处理,将上述已消化好的cDNA,经Mini Column收集大于400bp的双链cDNA。
1.2.5 cDNA的重组与噬菌体的体外包装取上述分 离 的 双 链cDNA与T7Select 10-3b VectorArms连接,T7Select 10-3bVector Arms为2端分别带 有EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ切割位点的噬菌体DNA,可与经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ消化的双链cD-NA 2端互补,在T4DNA连接酶作用下,16℃连接过夜,形成重组T7Select 10-3b载体。其合成流程图见图1。取总连接产物5μL与25μL包装蛋白(T7Select Packaging Extract)混 合,22 ℃包 装2h,得到具有感染性的T7噬菌体颗粒。
1.2.6 T7噬菌体展示文库的鉴定1.2.6.1 T7噬菌体文库的扩增将全部包装产物与37℃振荡培养至D600nm为1的BLT5403菌液混合,按5×104个噬菌斑/板,铺150 mm LB平板,37℃倒置培养3~4h。平板上噬菌斑长到直径为1~2mm时,每块板加10mL噬菌体提取缓冲液覆盖平板,4℃存贮过夜。次日收集噬菌体提取缓冲液,加0.5mL氯仿,5000r/min离心5min,收集上清。取10μL上清进行梯度稀释、铺板、测定扩增后噬菌体展示文库的滴度。在扩增产物中加入1/10体积80%灭菌甘油,分装后于-70℃保存。
1.2.6.2 T7噬菌体文库容量测定将甘油存贮的BLT5403菌种接种到琼脂平板上,37 ℃培养过夜。
用接种针挑取单个菌落,置于LB液体培养基中,37℃振荡培养至D600nm为1。取10μL文库,用无菌LB作101~108系列倍比稀释。取6个灭菌的1.5mL离心管,每管中加入250μL D600nm为1的BLT5403菌 液,将103~108稀释 的文库各取100μL分别加入含菌液的1.5mL离心管内,轻轻混合,37℃水浴10min,加入到4mL融化的顶层培养基内,将顶层培养基立即倒入预热至37 ℃的LB平板,待顶层培养基凝固后于37 ℃倒置培养3h。当LB平板上长出噬菌斑后,计数噬菌斑数目并计算文库滴度。计算公式为:文库滴度 (PFU/mL)=噬菌斑数×稀释度/铺板用提取物体积。
1.2.6.3 T7噬菌体文库重组率的测定用无菌枪尖从原始包装物滴度测定平板上挑取100个噬菌斑,分别加入含100μL 10 mmol/L EDTA(pH8.0)的离心管内,旋涡振荡30s,65℃加热10min。
冷却至室温,10000r/min离心3min,上清含噬菌体裂解物。以噬菌体裂解物为模板,利用试剂盒中提供的T7上、下游引物进行PCR扩增。PCR反应条件为:94℃预变性3min;94℃变性1min,50℃退火1min;72℃延伸2.5min,30个循环;72 ℃再延伸7min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。
2、结果与分析
2.1总RNA的提取结果经紫外分光光度法测定,犊牛口腔黏膜上皮细胞总RNA产 量 为1260μg,D260nm/D280nm=1.96,表明提取的RNA纯度较高;电泳结果显示28S和18SRNA条带均清晰(图2),表明提取的总RNA未发生降解。
2.2 mRNA分离结果分离纯化的mRNA电泳结果见图3。其产量为4.5μg,D260nm/D280nm=1.99,表明分离的mRNA纯度高,可以用于cDNA合成。
2.3 T7噬菌体展示文库的鉴定本试验构建的犊牛口腔黏膜上皮细胞T7噬菌体展示文库未扩增文库的滴度为1.3×107PFU/mL,对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,文库重组率为95.8%,95%的插入片段大于400bp(图4),扩增后文库滴度为2.6×1010PFU/mL,符合文库构建要求。
3、讨论
VSV是引起人和多种哺乳动物水泡性口炎的病原。水泡性口炎的临床症状与口蹄疫(FMD)、猪水泡病(SVD)等极为相似,在兽医临床上易造成误诊。
VSV与其宿主细胞表面受体的结合而吸附在宿主细胞上是病毒感染的第一必备步骤(Rose等,2000)。因此,深入探讨VSV感染发病的分子机制,明确其细胞表面受体性质,对于水泡性口炎的预防和治疗有十分重要的意义。已有的大量研究提出,VSV囊膜G蛋白是病毒吸附至细胞特异性受体的配体蛋白(Georgel等,2007)。所以,目前研究者们主要致力于研究和发现细胞膜表面VSV的受体,为探讨VSV感染上皮细胞的机制奠定基础。
本研究中运用的噬菌体展示技术是将编码蛋白的cDNA序列克隆入噬菌体的基因序列上,这样cDNA编码的蛋白或多肽就与噬菌体外壳蛋白融合表达,从而构建出蛋白的表面展示文库(魏东芝等,2000)。这种将基因型和表型联系在一起的技术,可通过蛋白的相互作用来分离和鉴定出表达有目标蛋白的噬菌体重组子,且获取编码目标蛋白的核苷酸序列。构建适合于筛选VSV相互作用受体蛋白的cDNA展示文库,首先应保证构建文库所需的细胞含有高亲和力和(或)较高丰度的相互作用蛋白。
VSV具有嗜上皮性,可通过与犊牛口腔黏膜上皮细胞膜上受体结合感染细胞,故选用犊牛口腔黏膜上皮细胞作为建库良好的细胞来源。
从理论上讲,当一个cDNA文库具有106以上的库容量时,就能以99%的概率保证文库中包含有细胞表达出的任何一种mRNA序列信息(沈倍奋,2001)。本试验所构建文库包含独立重组子1.3×107,具有较高的库容量。本试验采用了随机引物引导合成cDNA第1链,该法可合成出大小长度不等的cDNA片断,它们分别代表了mRNA各部分区域的序列,从而反映出mRNA所携带信息。另外,据SCOP数据库推算,如果文库中cDNA插入片断达到300bp以上,就可以代表蛋白的各个功能域(Santi等,2000)。所建文库的cDNA插入片段长度在0.4~2kb之间,平均长度为600bp,表明文库中的重组cDNA片段能代表蛋白各功能域的序列信息。而蛋白功能域是蛋白相互作用的基础,因此所建文库能有效地运用于蛋白相互作用的研究(刘太峰等,2012;Benhar,2012;Arap,2005)。
综上所述,本试验利用噬菌体展示技术,成功构建了对VSV具有高反应性的犊牛口腔黏膜上皮细胞高质量cDNA表达文库。这为高通量地从文库中筛选出能与VSV相互作用的噬菌体重组子、为寻找VSV相互作用受体蛋白奠定了坚实的基础。
除此之外,已成功构建的犊牛口腔黏膜上皮细胞的cDNA表达文库还具有广泛的运用空间,可用于犊牛口腔黏膜上皮细胞的基因功能组学、蛋白质组学和多肽药物的开发等众多领域,从而为探讨VSV的感染途径和发生机制及寻求诊断和治疗的新途径提供重要工具。
参考文献：
1．刘太峰,孟庆峰,段小波,等.cDNA文库构建方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2012,39(7):40~43.
2．闫守庆,张玉静.噬菌体表面呈现技术及在疫苗研制中的应用[J].黑龙江医学,2003,27(2):110~121.
3．沈倍奋.分子文库[M].北京:科学出版社,2001.
4．侯云德.分子病毒学[M].北京:科学出版社,1990.
5．殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版.北京:科学出版社,1997.
6．魏东芝,赖敏.噬菌体抗体库筛选技术[J].生命科学,2000,12(3):134~137.
