牛病毒性腹泻－黏膜病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒所致的一种广为传播的世界性传染病，以消化道黏膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为主要特征。自1946年P．Olafson首先在纽约州腹泻牛中发现并报道了牛病毒性腹泻病以来，至今该病已呈世界性分布，大多数养牛国家都有流行。
近年来，随着我国畜牧业的不断发展，牛病毒性腹泻－黏膜病在我国的流行情况日益扩大，已经严重阻碍了我国畜牧业的健康发展，经济损失巨大。
同时，该病在我国鹿养殖场流行广泛，已成为鹿三大主要传染病之一，牛病毒性腹泻病毒是鹿顽固性腹泻的主要病原。本文对牛病毒性腹泻－黏膜病的流行现状及现有诊断技术予以总结，以便为该病的防制研究提供理论基础。
1 病原学
牛病毒性腹泻－黏膜病病毒(BVDV)，又称黏膜病病毒(MDV)，属于黄病毒科，与猪瘟病毒(CSFV)和羊边界病病毒(BDV)同属，它们除有共同的可溶性抗原、发生交叉反应外，还在基因结构和抗原性上有60%以上的同源性。该病毒为单股正链ＲNA，有感染性，且具有囊膜结构。
BVDV根据其病变特性，可分为致细胞病变型(CP)和非致细胞病变型(NCP)两种生物型。
从1960年到现在，经过不断摸索，BVDV已经适应于牛肾传代细胞系MDBK，多用于病毒的病变观察、培养增殖、疫苗制备及诊断研究。
2 流行现状
1946年，P．Olafson首先在纽约州腹泻牛中发现并报道了牛病毒性腹泻病，随后分离到该病毒。1953年，Ｒansey等发现了牛黏膜病。
Gillespie等于1961年证实两种病均为同一种病毒引起。1971年，由美国兽医协会将该病统一命名为牛病毒性腹泻－黏膜病。该病呈世界性分布，广泛存在于七大洲养牛业较为发达的国家。
国外学者Violeta等从1997—2001年间对立陶宛境内27个地区共147个畜群BVDV流行情况进行调查，结果显示，呈阳性比率为11.9%～100%。Talafha等于2009年报道，约旦境内野生动物和人工饲养畜群血清阳性率分别为32%和81%，而加拿大境内未免疫动物和人工免疫畜群血清阳性率分别为28%和9%。由此可见，建立良好的防控机制对控制该病的发生和蔓延有一定作用。2008年，Ｒobert等从美国南部地区30个牛场采集4530份幼牛样本，应用免疫组化试验和ELISA法检测，结果阳性率为0.55%(25头)，且阳性动物只来源于其中5个牛场。
1980年，我国从丹麦、加拿大、新西兰、美国等十几个国家引进血清、精液、种牛和奶牛，将本病带入我国。由于控制不当，对牛、鹿、羊、猪、马等均造成不同程度的感染，从而蔓延全国。
1983年，李佑民等首次从流产胎牛的脾脏中分离到BVDV。2000年，杜锐等应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELIAS)对吉林地区幼鹿BVDV感染进行了流行病学调查，结果显示，该地区幼鹿感染率为60.0%～86.7%。2003年，虞蕴如等［17］通过对南京市初生犊牛进行血清学调查，结果显示，该地区BVD－MD阳性率为25.96%。
2004年，张光辉等采用微量细胞中和试验和双抗体夹心ELISA试剂盒分别对河南省规模化肉牛场和散养户进行流行动态调查研究，结果显示，BVD－MD检测肉牛的抗体阳性率为21.0%，牛群的阳性带毒率高者可达23.53%。2006年，赵月兰等采用改进的双抗体夹心ELISA试验法对河北省奶牛场随机采集直肠粪便进行血清学调查，结果显示该地区不同年龄的奶牛均可感染BVD－MDV，最高阳性检出率为81.4%，平均检出率为40.9%。2007年，金爱华等对上海市奉贤区奶牛场随机采血样进行血清学调查，结果显示，该区牛场中奶牛BVD抗体阳性率为34.06%。
2011年，范仲鑫等对湖南规模奶牛场进行血清学调查，结果显示，该地区BVD－MD阳性率达92.17%。2012年，王金涛等对黑龙江省规模化奶牛场奶牛随机采集尾静脉血样进行血清学调查，结果显示，在感染BVD－MDV的1434份血清中，阳性血清为23份，阳性率为1.6%。2012年，叶成玉等对青海天峻县半野血牦牛随机采集颈静脉血进行流行病学调查，结果显示，该地区BVD－MD血清阳性率为38.04%。2013年，康晓冬等采用双抗原夹心酶联免疫吸附试验方法对宁夏奶牛养殖场进行血清学调查，结果显示，该地区BVD－MD被检牛场血清阳性率为30.77%，被检奶牛血清阳性率平均为2.56%。高双娣等采用微量中和试验对陕西、甘肃、宁夏、青海和四川5个省(区)部分地区的黄牛群、牦牛群进行血清学调查，结果显示，黄牛群阳性检出率为46.15%。由此可见，近年来，国内BVDV的感染情况日益扩大，对国内、国际社会均造成较大的经济损失。
3 牛病毒性腹泻－黏膜病病毒诊断
3．1 病毒分离和鉴定
一般通过采取病畜的血液、口鼻分泌物以及脾和肠系膜淋巴结，处理后接种于胎牛肾细胞、犊牛肾细胞、犊牛睾丸细胞等进行病毒的分离和鉴定，研究表明，以犊牛睾丸细胞最敏感。王新平等、杜锐等分别从牛、幼鹿等易感动物中分离到病毒。但病毒分离、鉴定耗时太长，且只能检测出致细胞病变型BVDV，故无法普及。
3．2 血清学诊断
3．2．1 中和试验
该法是进行牛病毒性腹泻－黏膜病流行病学调查的有效手段，也是实验室常用方法之一。通过每3～4周前后采血2次，将血清稀释后进行试验。如果第2次高于第1次4个滴度以上可判为阳性，2个滴度以上，视为疑似患病。但该方法检测出的阴性牛可能是免疫耐受牛，因此仅靠血清中和试验检测很难达到清群、完全监控的目的。
3．2．2 免疫琼脂扩散、该法简便易行，在我国基层兽医部门应用较普遍。通常选取溃烂或发炎组织周围黏膜直接与BVDV阳性血清进行反应检测抗原。同时也可取患病动物血清与标准阳性抗原进行抗体检测，但敏感性低于中和试验。陈茂盛等用该法检测BVDV抗体，并与微量中和试验进行对比分析，结果阳性率差异显著。国外学者亦有相同结论。免疫琼脂扩散只具有群特异性，不具备株特异性，准确性不高，因此不能替代微量血清中和试验。
3．2．3 蛋白A胶体金免疫电镜技术
电镜观察法快速简便，可直接对病料或细胞培养物进行复染，观察病毒粒子形态。但易受到形态相似的病毒粒子干扰，导致特异性和敏感性较低，且病毒粒子本身难于观察，需病毒数量在107个/mL以上。
因此，仅用电镜观察鉴定较困难。而PAG－IEM技术电子密度高，可通过快速扫描网格，以较低倍数检出病原。常国权等以蛋白A胶体金免疫电镜技术(PAG－IEM)法、免疫电镜吸附法(IEM)和直接负染色电镜法(DEM)同时检测疑似患病动物的粪便样品。结果表明，PAG－IEM方便快速，3～4h即可诊断结果，而且敏感性较IEM高300～500倍、DEM1000倍以上。本法对检测经过挑选或疑似样品内所含的病毒粒子快速、敏感且特异性好，但目前仍不适于大量样品筛选。
3．2．4 免疫过氧化物酶技术(IPT)
该方法诊断牛病毒性腹泻－黏膜病准确可靠，目前被广泛用于抗原的分布和抗体检测。该法通过对单层细胞培养物进行检测，使感染BVDV的细胞浓染，而未受BVDV感染细胞无色，其结果用肉眼或显微镜便可直接观察。研究表明，将单克隆抗体和生物素化抗鼠抗体－链酶亲和素过氧化物酶检测系统相结合，可提高其特异性。
3．2．5 免疫荧光技术(IFT)
免疫荧光技术集免疫学的敏感性、特异性和显微镜的精确性于一身，可快速检测感染细胞培养物和病变组织切片中的病毒粒子。Ｒebby等用NADL株感染MDBK单层细胞，对54份患病牛血清进行检测，其结果与所建立间接ELISA检测法一致。魏志强等用BVDV感染牛白细胞与血清进行荧光抗体检测，结果显示，白细胞和血清中的病毒消长情况差异不大。我国进出口检疫条款规定，以荧光抗体同时对白细胞和血清进行监测，两者出现一种特异性荧光即为阳性。虽然免疫荧光技术是一种可靠的实验室诊断方法，但需要佐以荧光显微镜，并不适用于基层使用。
3．2．6 酶联免疫吸附试验(ELISA)
ELISA检测法作为经典的血清学检测方法，在国内外广泛应用。该法即可检测存在于各种病料中的BVDV，也可以检测患病动物体内BVDV抗体水平，是诊断牛病毒性腹泻－黏膜病的一种重要的常规手段。王新平等于1995年研制了用于检测血清中和抗体的双抗体夹心阻断ELISA诊断试剂盒，其敏感性高出中和试验5个滴度。Shammon等利用BVDV单克隆抗体建立了抗原捕获ELISA检测法，用于检测BVDV抗原。此方法由Homer改良后与PCＲ方法比较，结果表明，ELISA法的敏感性低于PCＲ法。张光辉同样以单克隆抗体建立了双抗夹心ELISA法，其检测结果与中和试验和病毒分离试验符合率分别为93.3%和86.7%。虽然此法简单快速，且特异性良好，但鉴于制备特异性抗原困难，并且假阳性、阴性等问题的存在，使本方法在实际应用上受到限制。
3．3 BVDV的分子生物学检测技术
3．3．1 核酸扩增技术
随着分子生物学检测技术被应用于牛病毒性腹泻－黏膜病的诊断，核酸扩增技术目前已成为应用较广泛的实验室诊断方法。应用于牛病毒性腹泻诊断中的主要有环介导体外等温扩增(LAMP)技术，实时荧光定量(Taq-Man)ＲT－PCＲ、套式ＲT－PCＲ、一步法ＲT－PCＲ、二重ＲT－PCＲ等。该技术能从分子水平上简单快速，敏感特异地检测出样品中BVDV的ＲNA，并且可以区分不同基因型的BVDV毒株以及与BVDV在基因组成、传播途径、检测方法等方面相似的其他病原体，如猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病毒(BDV)、水泡性口炎病毒(VSV)等。范晴等根据BVDV5'UTＲ的保守区设计LAMP特异性引物，建立了恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法，该方法可检测到的阳性质粒临界值为1个拷贝，可依据浑浊度或染料的辅助直接判定结果。郭锐等根据BVDV的保守序列，设计特异性PCＲ引物和1条TaqMan荧光探针，建立了实时荧光定量PCＲ检测方法，该方法检测灵敏度为103拷贝/μL，重复性好，定量线性范围为1.0×(103～108)拷贝/μL。王克伟等根据针对BVDV5'UTＲ和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PＲＲSV)N蛋白的基因序列所设计的特异性引物，建立了BVDV和PＲＲSV双重ＲT－PCＲ的检测方法。该方法特异性强，敏感性高，对于PＲＲSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10－4ng和7×10－4ng。用该方法对临床样本进行检测，结果与PＲＲSV和BVDV单一ＲT－PCＲ的检测结果符合率分别为89.3%和92%。PCＲ技术诊断BVDV具有简便、快速、敏感性高和特异性强等优点，只是基因扩增所需的仪器和试剂价格昂贵，目前还不能广泛应用于生产实践。
3．3．2 核酸探针杂交技术
核酸探针杂交技术是20世纪80年代兴起的一类分子生物学技术，与传统的检测方法相比，核酸探针杂交技术应用广泛，敏感性高，特异性强。早期的放射性同位素(如32P、35P)标记探针，其具有放射性危害、不稳定等缺点。后来发明的生物素标记的DNA探针虽然不具有放射性危害，但其特异性和敏感性有时均不如放射性同位素标记探针。目前，应用较多的是地高辛标记核酸探针，它不仅不具有放射性，而且与放射性同位素标记探针一样，高度敏感特异。Jimmy等用NADL株的4种不同基因片段(P80、P54、gP62、gP53)作为杂交探针，通过斑点免疫印迹方法检测出BVDV的24个细胞病变株和37个非细胞病变株，其中在检测致细胞病变株时P80和P54的杂交率可达90%以上。
4 小结
牛病毒性腹泻－黏膜病自发现以来，在世界范围内一直广泛流行，因其具有多种基因型和基因亚型，且致病机理比较复杂，可产生持续性感染和免疫耐受，造成该病难防、难控的现状。虽然在诊断方法上，各国学者做了大量研究，但仍不能从根本上杜绝该病的流行。因而研制一种可靠有效的防疫疫苗，越来越受到国际社会的重视。近年来，国内外许多学者致力于牛病毒性腹泻－黏膜病病毒分子结构和蛋白功能等方面的研究，特别是近年来对其主要保护性抗原E0和E2的研究，为诊断技术的革新及新型疫苗开发奠定了坚实的基础。BVDV防制工作必将有突破性的进展。
