内皮细胞衰老引起的内皮细胞功能减退是心脑血管疾病随年龄增加的主要因素之一[1-2].氧化应激是导致细胞衰老的主要原因之一。随着年龄的增加，内皮细胞活性氧（ reactive oxygen species,ROS）的产生增多、清除减少，导致其在内皮细胞内积聚，并最终导致内皮细胞衰老、损伤及功能失调[3].
Sirtuins 家族是一类依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸（ NAD） 的组蛋白去乙酰化酶，Sirt3 是 Sirtuins 家族的成员[4].研究表明，Sirt3 可通过去乙酰化相关蛋白，抑制线粒体内 ROS 的蓄积[5].提示 Sirt3 可通过抑制血管内皮细胞线粒体内 ROS 的蓄积，抑制血管内皮细胞的衰老过程。本研究通过 Sirt3-siRNA抑制 Sirt3 蛋白的表达，观察人脐静脉内皮细胞（ hu-man umbilical vein endothelial cells,HUVECs ） β-gal阳性染色率、细胞衰老相关蛋白 P16 及 P21 的表达、ROS 蓄积水平，旨在探讨 Sirt3 对 HUVECs 衰老的影响及其可能的机制。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验细胞 HUVECs,购自美国 ATCC 公司。
1. 1. 2 主要试剂 ECM 培养基购自美国 Sciencell公司； 胰蛋白酶、DCFH-DA 均购自美国 Sigma 公司； Sirt3-siRNA 序列由上海吉玛生物制药有限公司合成； 脂质体 LipofectamineTM2000 购自美国 Inven-trogen 公司； Opti-MEM 购自美国 Gibco 公司； β-半乳糖苷酶染色试剂盒、免疫印迹试剂盒和 BCA 蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；兔来源 Sirt3 单克隆抗体、小鼠来源 P16 单克隆抗体、兔来源 P21 单克隆抗体均购自美国 Santa CruzBiotechnology 公司； 兔来源 β-actin 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 HUVECs 的培养与分组 将复苏后的HUVECs接种于 ECM 培养基中，置于 37 ℃ 、5% CO2细胞孵育箱中常规培养。取 3 ~7 代 HUVECs 种板并行同步化处理，并将细胞分为对照组和 Sirt3-siRNA 组。
1. 2. 2 Sirt3-siRNA 转染 HUVECs 及抑制序列的筛选 用不含抗生素的培养基接种细胞于 6 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 24 h,转染时细胞的融合度达到 50%左右。实验分为对照组、抑制序列 1 组、抑制序列 2 组、抑制序列 3 组。各抑制序列均根据 Sirt3 mRNA 序列以化学合成法设计合成。3 条抑制序列分别为： 抑制序列 1,Sirt3-homo-340;抑制 序 列 2,Sirt3-homo-752; 抑 制 序 列 3,Sirt3-homo-1613.转染方法按 LipofectamineTM2000 说明书操作。转染 48 h 后提取细胞总蛋白，用 Westernblotting 法筛选出抑制效率最高的一组抑制序列。
1. 2. 3 Western blotting 法检测细胞中 Sirt3、P16 及P21 的蛋白表达 应用细胞裂解液（ RIPA 与 PMSF按 100∶1 配制） 充分裂解细胞，提取各组 HUVECs总蛋白，用 BCA 蛋白定量试剂盒测定各样品蛋白浓度，并调整各样品上样量为 40 μg,行 8% ~ 12%SDS-PAGE 凝胶电泳后转到 PVDF 膜上。5% 的脱脂奶粉室温封闭 2 h 后，分别加入兔抗 Sirt3、鼠抗P16、兔抗 P21 和兔抗 β-actin 抗体 4 ℃ 摇床过夜。第 2 天用 1 × TBST 洗膜后，在辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠 IgG 中室温孵育 1 h,1 ×TBST 洗涤后进行暗室曝光显影。Image J 软件测量相对灰度值。
1. 2. 4 β-半乳糖苷酶染色法检测 HUVECs 的衰老具体步骤根据试剂盒说明操作。待 Sirt3-siRNA刺激细胞 48 h 后，弃去 6 孔板中的原培养基，用PBS 冲洗 3 遍后，加入 4% 的多聚甲醛固定 20 min.再用 PBS 冲洗 3 遍后，加入 2 mL 染色工作液 37 ℃孵育过夜。普通光学显微镜下观察。
1. 2. 5 DCFH-DA 法测定 HUVECs 内 ROS 水平待 Sirt3-siRNA 刺激细胞48 h 后，弃去6 孔板中的原培养基，用 PBS 冲洗 2 遍后，加入含终浓度为 10 μmolDCFH-DA 的无血清培养基 1 mL.37 ℃ 、5% CO2细胞孵育箱中孵育 20 min 后，用无血清培养基冲洗3 遍，于激光共聚焦显微镜下观察 ROS 荧光强度并拍照。
1. 3 统计学处理 采用 GraphPad Prism 6 软件，所有数据均以 x珋 ± s 表示，对照组与 3 个抑制序列组比较采用单因素方差分析； Sirt3-siRNA 组与对照组比较采用 t 检验。P <0. 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 Sirt3-siRNA 抑制序列的筛选 见图 1.3 组抑制序列中，抑制序列 1 的 Sirt3 蛋白表达量最低，且明显低于对照组，所以抑制序列 1 抑制效率最高，故选择序列 1 进行后续实验。
2. 2 Sirt3-siRNA 对衰老相关基因 P16 和 P21 蛋白表达的影响 见图 2.结果显示与对照组相比，Sirt3-siRNA 组 Sirt3 蛋白表达明显减少，P16 和 P21蛋白表达水平明显升高（ P <0. 05） .
2. 3 HUVECs β-半乳糖苷酶染色 见图 3.结果显示，Sirt3-siRNA 组 β-半乳糖苷酶染色阳性率明显高于对照组。
2. 4 HUVECs 内 ROS 水平 见图 4.结果显示，与 对照组相比，Sirt3-siRNA 组细胞内 ROS 水平升高。
3 讨 论
研究表明，衰老是心脑血管疾病的独立危险因素，如高血压、冠心病、脑卒中等的发病率随着年龄的增长而急剧上升。因此研究血管内皮细胞衰老发生的机制有助于改善血管内皮细胞功能，以预防和延缓心脑血管疾病的发生发展。
Sirtuin 家族中成员有 7 个： Sirt1 ~ Sirt7,其在细胞内分布广泛、功能多样。研究表明，Sirtuins 家族成员有抗衰老的作用，可延缓衰老相关的心脏疾病[6]、癌症[7-8]等发生发展。Sirt3 的激活被证实与延长人类寿命相关，其组织器官分布广泛，在代谢活动活跃的组织如肌肉、肝脏、心脏、棕色脂肪组织中高表达[4].细胞衰老过程是通过信号转导通路来实现的，其中，端粒酶非依赖的 P16INK4a-Rb 途径和端粒酶依赖的 P19Arf-P53-P21Cipl 途径是两条关键的衰老信号转导通路，其中任何一条通路的激活都可诱导衰老[9].因此 P16 和 P21 是调控细胞衰老的关键基因，P16 和 P21 的表达升高可导致早衰。
本研究结果显示，Sirt3-siRNA 抑制 Sirt3 的表达后，HUVECs 中细胞衰老相关蛋白 P16、P21 及细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率均显著增高。提示，Sirt3-siRNA 抑制 Sirt3 的蛋白表达后，促进了 HUVECs的衰老过程。
氧化应激是目前公认的诱导细胞衰老的主要因素之一[10].线粒体是 ROS 产生的主要场所，Sirt3主要定位于细胞线粒体中。研究发现，Sirt3 可以通过去 乙 酰 化 Foxo3a 提 高 锰 超 氧 化 物 歧 化 酶（ Mn-SOD） 及过氧化氢酶（ CAT） 的表达，从而提高细胞内 ROS 清除能力[11-12].另外，Sirt3 能够通过去乙酰化激活长链酰基辅酶 A 脱氢酶（ LCAD） 、琥珀酸脱氢酶 （ Sdh） 、异柠檬酸脱氢酶 2 （ Idh2） 、NADH 脱氢酶等关键酶[13-16],增强线粒体氧化呼吸作用，从而减少了 ROS 的生成。本实验结果显示，Sirt3-siRNA 抑制 HUVECs Sirt3 蛋白表达后，HUVECs内的 ROS 水平明显降低。Sirtuin 家族另一成员Sirt1 也被发现可预防氧化应激诱导的HUVECs早衰的发展[17].
综上所述，我们认为，Sirt3 可通过减少细胞中ROS 的蓄积来延缓 HUVECs 的衰老进程。
参考文献：
[1] Paneni F,Costantino S,Cosentino F. Molecular path-ways of arterial aging[J]. Clin Sci （ Lond） ,2015,128（ 2） : 69-79.
[2]Wang M,Jiang L,Monticone RE,et al. Proinflamma-tion: the key to arterial aging[J]. Trends EndocrinolMetab,2014,25（ 2） : 72-79.
[3]Oeseburg H,Iusuf D,van der Harst P,et al. Bradykininprotects against oxidative stress-induced endothelial cellsenescence[J]. Hypertension,2009,53（ 2） : 417-422.
[4]时小燕，杜丽敏。 Sirtuin 家族成员及其生物学特性[J].国际药学研究杂志，2011,38（ 5） : 349-355.
