学术堂首页 | 文献求助论文范文 | 论文题目 | 参考文献 | 开题报告 | 论文格式 | 摘要提纲 | 论文致谢 | 论文查重 | 论文答辩 | 论文发表 | 期刊杂志 | 论文写作 | 论文PPT
学术堂专业论文学习平台您当前的位置:学术堂 > 生物学论文 > 细胞生物学论文

小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨

来源:学术堂 作者:韩老师
发布于:2014-11-25 共5492字
论文摘要

  卵泡是卵巢内的基本功能单位,包含一个卵母细胞、颗粒细胞及膜细胞〔1〕。卵泡膜间质细胞 ( theca -interstitial cells,TIC) 是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的间质细胞,它在卵泡的生长发育、闭锁过程中发挥着多种重要作用〔2 -4〕,同时作为卵巢微环境的主体成分之一,TIC 参与了卵巢衰老〔5〕及多囊卵巢综合征等卵巢相关疾病〔6〕的发生发展。为了能够进一步深入研究 TIC 对卵巢功能的影响及其作用机制,在体外构建一个可最大程度模拟体内环境下卵泡与TIC 相互关系的共培养模型是十分有意义的。目前卵泡的培养主要包括二维法和三维法,而共培养方法包括直接接触式和非直接接触式。本研究拟采用海藻酸钠凝胶 ( alginate hydrogel,ALG) 和 Transwell 构建 3种共培养模型,从卵泡的形态观察、生长发育、存活率、激素分泌水平和减数分裂恢复情况等方面进行综合评价,旨在探索一种最佳的共培养方法。

  1 材料和方法

  1. 1 实验动物 由武汉大学动物实验中心提供 SPF级 C57BL/6 小鼠,动物处理过程遵守动物保护与使用原则,并获华中科技大学同济医学院动物保护委员会批准。

  1. 2 主要试剂 Lebovitz's L -15 培养基( Invitrogen) 、-MEM 培养基 ( Hyclone) 、注射用重组人促卵泡激素( Merck serono) 、FBS( Gibco) 及 hCG( 赤峰博恩药业有限公司) ,其他试剂均购自 sigma 公司。

  1. 3 卵泡膜间质细胞的分离与培养 分离 21 ~ 25 日龄 C57BL/6 雌鼠的卵巢,针刺以尽量多地释放出卵泡中的颗粒细胞。将残余组织充分剪碎后用消化液( McCoy's 5a 培养基 +4 mg/ml 胶原酶Ⅳ +10%胎牛血清) 37℃消化 1 h,每 15 min 吹打 1 次。将消化好的细胞 悬 液 进 行 离 心 ( 1 000 rpm,5 min) ,并 用McCoy's 5a 培养基清洗 1 次。最后所得的细胞用 TIC 培养基 ( McCoy's 5a 培养基 +10% 胎牛血清 +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 重悬,接种于 24 孔板或 Transwell 滤膜 ( Corning,#3422) 底侧面 ( 倒置于 12 孔板中) ,每孔细胞数约为 1 × 105个,置于37℃ 、95% O2~ 5% CO2培养箱中培养 24 h,细胞贴壁后将 Tranwell 按正常位置置于24 孔板中,加入 TIC培养基。

  1. 4 窦前卵泡的分离 用 29 号胰岛素针针头针刺14 ~ 16 日龄 C57BL /6 雌鼠的卵巢,分离得到窦前卵泡,置于维持液 ( -MEM 培养基 +1%FBS +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 中,37℃、95% O2~5% CO2培养箱中孵育 30 min。选择具备以下特征的健康卵泡用以下一步包埋或培养: ①直径在110 ~140 μm之间; ②具有完整连续的基底膜,无明显因操作造成的卵泡损伤; ③卵泡中央可见一个未成熟的卵母细胞; ④无明显窦腔形成。

  1. 5 卵泡与卵泡膜间质细胞的共培养
  
  1. 5. 1 海藻酸钠凝胶法 将卵泡膜间质细胞接种于 24孔板底部,孵育过夜,更换卵泡生长培养基 ( - MEM培养基 + 10%FBS +ITS +10 mIU/ml FSH +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) ,600 l/孔。将 5 个窦前卵泡转移至 2% ( w/v) 无菌海藻酸钠液珠中,充分浸入包埋液 ( 50 mM CaCl2+ 140 mM NaCl) 中交联2 min形成凝胶,再将海藻酸钠胶珠置入 24 孔板内,记为共培养第零天。

  1. 5. 2 Transwell 间接接触法 将卵泡膜间质细胞接种于 24 孔板底部,更换 500 μl 卵泡生长培养基,放入 Transwell 小室,加入 100 μl 卵泡生长培养基,直接吸取 5 个卵泡转移至上室内。

  1. 5. 3 Transwell 直接接触法 将培养于 Transwell 小室底侧面的卵泡膜间质细胞置于 500 μl 卵泡生长培养基中,直接吸取 5 个卵泡转移至含 100 μl 卵泡生长培养基的上室内。

  1. 5. 4 培养基更换 每组包含 20 ~ 30 个卵泡,于37℃ 、95% O2~ 5% CO2培养箱中培养 6 天,隔天半量更换新鲜配制的卵泡生长培养基,收集培养基冻存于 -80℃,用于激素检测。

  1. 6 评价方法
  
  1. 6. 1 卵泡形态、直径、存活率监测〔7〕: 从第 1 天开始,隔天用倒置相差显微镜观察卵泡形态并拍照,用 ImageJ 软件测量卵泡直径 ( 取长轴和短轴的平均值) 。通过观察卵泡形态判断是否存活,将具有以下特征的卵泡视为死亡卵泡: ①卵泡或卵母细胞碎裂、皱缩,尺寸缩减; ②卵母细胞不再由颗粒细胞层包绕; ③颗粒细胞变暗或碎裂。

  1. 6. 2 激素分析 收集共培养第 2、4、6 天 1 /2 的培养基冻存于 -80℃冰箱,用直接化学发光法测定睾酮、雌二醇。

  1. 6. 3 卵母细胞的减数分裂能力评价〔7 -8〕: 培养结束后,用含 10IU/ml 海藻酸钠裂解酶的 - MEM 培养基替换原有的培养基,在 37℃、95% O2~ 5% CO2培养箱中孵育30 min。将卵泡从裂解的海藻酸钠凝胶中转移至成熟培养基 ( maturation medium: - MEM 培养基 + 10% FBS + 5 ng/ml EGF + 1. 5 IU/ml hCG +100 IU / ml青霉素 + 0. 1 mg / ml 链霉素) 中,在 37℃ 、95% O2~ 5% CO2培养箱中孵育 16 ~20 h,进行体外成熟 ( IVM,in vitro maturation) 。然后用 0. 3% 透明质酸酶处理卵泡,并用吸管轻轻吹打,使卵母细胞从卵泡中裸露出来。观察卵母细胞并按以下方法进行分类: ①生发泡期 ( GV,germinal vesicle) : 卵母细胞在 hCG 的作用下未恢复减数分裂,可见卵母细胞的细胞核持续存在; ②生发泡破裂期( GVBD) : 卵母细胞核膜消失,生发泡不可见; ③减数第二次分裂期( MII,metaphase II) : 卵母细胞恢复减数分裂,停滞在减数第二次分裂期,在卵母细胞周围可见第一极体; ④退化( DG,degenerated) : 卵母细胞碎裂或皱缩。

  1. 7 统计分析 所有实验均独立重复 5 遍以上,运用 SPSS 18. 0 统计软件进行数据处理与分析,计量资料采用 ( x ± s) 表示,卵泡直径、激素水平的组间比较采用单因素方差分析 ( ANOVA) ,卵泡存活率和减数分裂阶段采用 χ2检验,P < 0. 05 表示有统计学差异。

  2 结果

  2. 1 3 种共培养方法下卵泡的生长发育 海藻酸钠凝胶包埋的卵泡在体外培养的 6 天中始终维持了卵泡的三维结构,并可以清晰观察到卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞 ( 图 1A - C) 。培养结束时可以观察到处于偏心位置的卵母细胞,部分卵泡的卵母细胞周围可见窦腔形成,而在 Transwell 中培养的两组,镜下观察到卵泡结构较不清晰,颗粒细胞与卵泡膜细胞的分界不清,在培养到第 3 天开始,卵泡内的颗粒细胞开始贴壁生长,卵泡直径急速增加,培养到第 5 天时,部分卵泡的颗粒细胞向外扩散增殖,导致卵泡结构的破坏,而这种现象在海藻酸钠凝胶法中的发生率很低。在 3 种共培养方法中,卵泡的生长发育均呈现出两个阶段 ( 图 2) : 培养第 5 天前,卵泡生长缓慢,之后卵泡则开始加速生长。在起始卵泡直径控制在110 ~ 140 μm 的前提下,在培养的第 1 天、第 3 天各组间卵泡直径均无统计学差异 ( P > 0. 05) ,卵泡存活率也无统计学差异 ( 分别 为 91. 1%、89. 1%、88. 2% ) ,见表 1。在培养到第 5 天时,海藻酸钠凝胶法的卵泡生长加速幅度明显低于 Transwell 内的两组,使得三维培养的卵泡直径小于 Transwell 内的卵泡 ( 180. 3 ± 39. 6) 、 ( 209. 4 ± 59. 3) 、 ( 226. 4 ±62. 6) μm,P < 0. 05,而 Transwell 直接接触法和间接接触法之间无统计学差异。第 5 天的卵泡存活率也出现差异,海藻酸钠凝胶法 ( 77. 3%) 和 Transwell直接接触法 ( 76. 5%) 要高于 Transwell 间接接触法( 57. 4%) ,P <0. 05,海藻酸钠凝胶法和 Transwell 直接接触法之间无统计学差异。【表1】

论文摘要

  2. 2 激素分泌 3 种共培养方法中,睾酮的分泌水平在第 2、4、6 天均逐渐升高,且各组间无明显差异( 图 3) ,而雌二醇水平在 3 组中的分泌情况与相应卵泡的直径增长情况相一致。第 2 天和第 4 天,3 组间均无统计学差异,但到第 6 天,Transwell 间接接触法( 2 752. 4 ±341. 6) pg/ml 和 Transwell 直接接触法 ( 2651. 0 ± 318. 9) pg / ml 中雌二醇的分泌量明显高于海藻酸钠凝胶法 ( 1 097. 6 ± 34. 0) pg/ml,P < 0. 001,Transwell 间接接触法和 Transwell 直接接触法之间无统计学差异。2. 3 体外成熟 ( IVM) 后卵母细胞减数分裂恢复情况 在体外培养 6 天后,选择镜下观察形态完整的存活卵泡进行体外成熟。在海藻酸钠凝胶法中 66. 7%的卵母细胞能够恢复减数第一次分裂,其中 17. 3%能够排出第一极体恢复减数第二次分裂,而 Transwell间接接触法和 Transwell 直接接触法的 GVBD 率分别为64. 2%、66. 7%,MII 率分别为 14. 0%、6. 0%。3组间在 GV、GVBD、MII、DG 的比例上均无统计学差异,见表 2。【表2】

论文摘要

  
  3 讨论

  海藻酸钠凝胶是近年来应用比较广泛的卵泡三维培养材料,在小鼠模型中可成功培养出活的、健康的、并能产生后代的卵泡,卵泡和卵母细胞均能生长达到与在体发育相似的直径〔9〕,而且颗粒细胞可进行增殖,分泌雌二醇、孕酮、雄烯二酮至周围培养基中。通过共培养方法,能够将卵泡体外培养的起始阶段提前至早期次级卵泡,甚至初级卵泡。如与胚胎成纤维细胞 ( MEFs)〔7〕进行共培养,这种常用于促进胚胎干细胞未分化生长的饲养细胞能够提供卵泡存活和生长所必需的关键旁分泌因子,从而使得早期次级卵泡 ( 平均直径为 90 ~100 μm) 和初级卵泡 ( 平均直径为 70 ~80 μm) 得以在体外生长至 251 ~347 m,形成窦腔,获得较高的存活率 ( 分别为 70% 和23% ) ,而且大多数的卵泡能够恢复减数分裂。有学者〔10〕利用卵巢间质细胞 ( 主要成分为膜细胞和卵巢巨噬细胞) 作为饲养细胞,模拟小卵泡在体内的环境,提高雄激素的生成,补充缺乏的细胞因子,显着促进了初级卵泡和早期次级卵泡的生长和存活。此外,在其他物种中,如水牛的大窦前卵泡与多种卵巢体细胞 ( 如卵丘细胞、颗粒细胞、卵巢间充质细胞、输卵管上皮细胞) 进行直接共培养也获得了成功〔11〕。

  Transwell 小室是一种多用途的带有多微孔膜的通透性支持物,可以允许细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子,使得细胞可以在更为自然的极性条件下生长,同时还提高了细胞的分化水平,使得体外生长的细胞在形态和功能上更为接近体内的细胞。Eppig 等人〔12〕用两步法体外培养始基卵泡,先将卵巢组织培养于核孔聚碳酸酯膜上,然后将卵母细胞 - 颗粒细胞复合物转移至 Transwell - COL 膜上培养,其中发生GVBD 的卵母细胞比例提高了 15% ~ 30% 。NayuduPL 等人〔13〕将小鼠窦前卵泡 ( 150 μm) 培养于 Millli-cell 膜上,在 FSH 的作用下,经过 6 ~ 7 天的培养,卵泡能够生长至大窦状卵泡 ( 直径 400 ~ 500 μm) ,并可高分泌雌激素。采用 Transwell 构建的间接接触和直接接触的共培养模型,便于对两种细胞类型分别进行观察和处理,可以更有效地进行现象和机制的研究。其中间接接触法中两种细胞被间隔于两个腔室中,没有直接的接触,而直接接触法模拟体外血脑屏障模型〔14〕将共培养细胞接种于多孔滤膜的上下两侧,则可以使两种细胞得到一定程度的接触,可能更接近于体内卵泡和卵泡膜间质细胞间的相互作用模式。

  在本研究中,海藻酸钠凝胶组的卵泡在体外培养阶段始终维持其三维结构,并且能够清晰辨认卵母细胞、颗粒细胞、基底膜及其周围的卵泡膜细胞,而Transwell 中培养的卵泡由于底层多微孔膜的影响,结构观察不清,而 3 种方法的卵泡在体外的生长发育都经历了缓慢生长期和加速生长期,这与 Mousset 等人〔15〕的研究中观察到的现象一致。经过体外 6 天的培养,3 组卵泡直径均增长至 180 ~230 m,与 Xu 等人〔16〕报道的培养至第 8 天时的卵泡直径相近,提示通过共培养可能促进了卵泡的生长。在卵泡培养的前3 天,各组间卵泡直径的增长幅度无统计学差异,但到第 5 天,Transwell 间接组和直接组卵泡直径明显大于海藻酸钠凝胶组,这可能与 Transwell 中卵泡呈二维式的平面生长,而海藻酸钠凝胶中卵泡维持三维立体生长,从而在镜下观察到的二维图像上显示了较小的直径有关,另一方面可能由于在 Transwell 聚碳酯膜上贴壁生长的颗粒细胞易于增殖,而海藻酸钠凝胶的硬度也在一定程度上限制了卵泡的生长。

  卵泡存活率在体外培养第 5 天也出现差异,海藻酸钠组 ( 77. 3%) 和 Transwell 直接组 ( 76. 5%) 要高于 Transwell 间接组 ( 57. 4%) ,P < 0. 05,提示卵泡三维结构的维持以及卵泡与卵泡膜间质细胞的直接接触可能有利于卵泡的存活。这与近些年的研究结果相一致,维持卵泡细胞与卵母细胞之间的相互作用,如缝隙连接、旁分泌效应,是卵泡发育的关键所在〔17〕。

  睾酮的分泌水平主要反映了卵泡膜间质细胞的功能,而雌激素合成则是卵泡的重要功能之一。在本研究中睾酮水平随着培养时间的延长逐渐升高,且在各个时间点 ( 第 2、4、6 天) 各组间均无统计学差异,说明 3 种共培养方法下卵泡膜间质细胞均能正常增殖和分化。雌二醇的水平也随着培养时间的延长逐渐升高,同时在第 6 天显现出差异,海藻酸钠凝胶法明显低于其他两种方法,这与相应的卵泡直径变化相一致。这种差异提示海藻酸钠凝胶法的卵泡和卵泡膜间质细胞之间的相互作用较 Transwell 中有所不同,可能主要体现在除睾酮外的其他激素分泌和一些旁分泌因子的差异上,如卵泡膜间质细胞能够产生 ckit 蛋白、BMP4、Smad3、TGF 、角 化 细 胞 生 长 因 子( KGF) 、肝细胞生长因子 ( HGF) 等,其中 ckit 蛋白能促进始基卵泡向初级卵泡发育和生殖细胞的迁移、增殖,BMP4 可促进始基卵泡向初级卵泡发育和卵母细胞的存活,KGF 能促进颗粒细胞的增殖〔18〕。

  此外,3 种共方法均能产生具备完整减数分裂能力的卵母细胞。

  通过对卵泡的形态观察、生长发育、存活率、激素分泌和卵母细胞减数分裂恢复能力方面的评价,海藻酸钠凝胶法具备便于观察、维持卵泡三维结构等优点,但卵泡的包埋和释放过程较为繁琐,且增加了对卵泡造成损伤的概率。同时,Transwell 直接接触法具有操作简便的优点,但不利于卵泡结构的维持,相应的成本较高,观察不够清晰。因此,建议短期 ( 5 天内) 的体外培养可以选择操作更简便的 Transwell 直接接触法,而长期培养则推荐能够维持卵泡三维结构的海藻酸钠凝胶法。

相关标签:
  • 报警平台
  • 网络监察
  • 备案信息
  • 举报中心
  • 传播文明
  • 诚信网站