一 、引言.
雄性生殖干细胞具有自我复制和分化成精子的能力,是动物体内唯一能进行遗传信息传递的干细胞。雄性生殖干细胞技术的发展和应用,将为克隆动物、濒危动物保种、转基因动物的生产、治疗雄性不育及一些人类遗传疾病的基因治疗提供新的机遇与途径。研究表明,雄性生殖干细胞可以诱导分化成特定类型的细胞,在再生医学治疗领域具有广阔的应用前景,是继ES细胞、沪S细胞之后的另一种细胞来源。
目前,关于哺乳动物雄性生殖干细胞的体外增殖与分化的大量研究主要集中在小鼠和人上,在其他动物的研究很少。本研究以新生犊牛翠丸为实验对象,探讨新生牛皋丸雄性生殖干细胞体外增殖与分化的相关影响因素和技术体系,以期为建立稳定、高效的家畜雄性生殖干细胞体外增殖与分化体系提供理论和实践依据。
材料与方法新生牛翠丸组织采用两步酶法消化,差速贴壁后进行培养,并添加GDN下和UF,形成集落后检测ocT-4、soxZ、Nanog、PGPg.5、GFRal、DAzL等标志基因。雄性生殖干细胞原代培养形成的集落消化,形成类胚体分化和直接诱导分化,检测单倍体的标志基因PRM一2和TP一l的表达。
二、结果.
雄性生殖干细胞与支持细胞共培养可形成葡萄串状集落和Es样集落,1oongmL一,的GDNF能显著促进雄性生殖干细胞以葡萄串状集落形式增殖,looolumL一’的uF能显著促进雄性生殖干细胞以ES样集落形式增殖。
雄性生殖干细胞集落KAP、OC科染色呈阳性,葡萄串状集落表达多能性的标志基因OC下4、SOXZ和精子发生的标志基因DaZI,ES样集落表达多能性的标志基因OCT-4、SOXZ、Nanog,不表达精子发生的标志基因。
雄性生殖干细胞集落在支持细胞饲养层进行传代培养,2%血清、100ngmL’,GDNF的培养液培养葡萄串状集效果较好,10%血清、1o00lumL一’LIF的培养液培养Es样集落效果较好。
雄性生殖干细胞集落消化吹打成单细胞悬液,进行悬滴培养能形成类胚体,类胚体贴壁后分化培养,10天后观察到州叭P一2呈阳性表达的神经样细胞。
分化培养卜2周后,能观察到胞质间桥相连的链状克隆和分化的类精母细胞、类圆形精细胞,培养4一5周后,能观察到精子样细胞,精子样细胞表达单倍体基因PRM一2和TPI。
三、结论.
利用低血清培养液并添加生长因子进行共培养,初步建立了新生牛翠丸雄性生殖干细胞体外增殖体系。将雄性生殖干细胞原代培养形成的串状克隆传代到支持细胞饲养层上进行分化,初步建立了新生牛翠丸雄性生殖干细胞体外分化体系。
