摘 要： 背景：软骨细胞是软骨修复工程种子细胞的来源，软骨细胞分化与软骨内骨化密切相关，软骨内骨化是必不可少的骨骼发育过程。SOX9对软骨细胞调控起着重要作用。目的：综述SOX9在不同水平对软骨细胞分化的调控机制的最新研究进展。方法：应用计算机检索CNKI、Pub Med及万方医学数据库从建库至2020年12月发表的相关文献，中文关键词为“软骨，软骨细胞，SOX9基因表达调控，转录后调控，蛋白质加工，翻译后修饰，功能伙伴”；英文关键词为“Cartilage,chondrocyte,posttranscriptional regulation,posttranslational modification,SOX9,transcriptional regulation,Gene Expression Regulation,SOX9 Transcription Factor”。最终纳入61篇符合标准的文献进行综述。结果与结论：在基因、RNA和蛋白质水平上参与SOX9调控的关键机制已经被发现，通过SOX9关键因子作用可以直接或间接促进软骨细胞成骨生长，有正向促进，也有反向抑制，以及各因素之间相互作用。SOX9是软骨细胞分化及促进软骨形成的关键因子；通过系统分析SOX9在不同水平调控的分子机制为软骨组织工程化提供理论基础，可以更快实现软骨疾病的临床治疗应用。
关键词 : 软骨;软骨细胞; SOX9;基因表达调控;转录;细胞分化; mRNA;骨关节炎;
Abstract： BACKGROUND: Chondrocytes are the source of seed cells for cartilage repair engineering. Chondrocyte differentiation is closely related to endochondral ossification, which is an essential for bone development. SOX9 plays an important role in the regulation of chondrocytes.OBJECTIVE: To review the latest research progress in the regulatory mechanism of SOX9 on chondrocyte differentiation at different levels.METHODS: A computer search was conducted for the relevant literatures published in CNKI, WanFang, and PubMed until December 2020. The key words were “cartilage, chondrocyte, regulation of SOX9 gene expression, posttranscriptional regulation, protein processing, posttranslational modification, functional partner” in Chinese and “cartilage, chondrocyte, posttranscriptional regulation, posttranslational modification, SOX9, transcriptional regulation, gene expression regulation, SOX9 transcription factor“ in English, respectively. Finally, 61 eligible articles were included for further review.RESULTS AND CONCLUSION: The key mechanisms involved in SOX9 regulation at the gene, RNA, and protein levels have been discovered. The SOX9 key factors can directly or indirectly promote osteogenic growth of chondrocytes, either positively or negatively, or even due to the interaction between various factors.SOX9 is a key factor in chondrocyte differentiation and chondrogenesis. By systematically analyzing the molecular mechanism of SOX9 regulation at different levels, the theoretical basis for cartilage tissue engineering can be provided, to accelerate the clinical treatment and application in cartilage diseases.
Keyword： cartilage; chondrocytes; SOX9; gene expression regulation; transcription; cell differentiation; mRNA; osteoarthritis;
0、引言Introduction
软骨是脊椎动物中一种独特且必不可少的组织，由独特的细胞类型软骨细胞构建和维持。软骨细胞和成骨细胞等其他细胞来源于骨骼干细胞的分化作用，软骨形成是关节软骨形成过程中的一个关键过程，始于骨髓间充质干细胞的凝结[1]。根据谱系特征，软骨细胞进行早期分化，以建立构成胚胎初级骨架的软骨原基[2]，然后它们将这些组织重塑成生长板或永久软骨。生长板是确保骨骼伸长和软骨逐渐被骨骼替代的临时结构，它们是由一层一层的软骨细胞按顺序分化而成的，早期细胞呈柱状增殖，晚期成熟为肥大前期细胞和肥大细胞，后者最终死亡或参与软骨内骨化成骨细胞转分化。在关节、呼吸和听觉系统，软骨细胞成熟为静止、低合成代谢细胞，从而确保软骨在一生中保持永久的稳态。精细的分子网络用于控制软骨细胞的规格和分化[2,3,4]，它们通过特定的转录因子组在基因水平上调节其作用，SOX9是其中的关键转录因子[5]。
SOX9属于一个由20个SRY相关的HMG盒蛋白(SOX)组成的家族，SOX9最初在间充质干细胞中表达，分化为软骨细胞和成骨细胞，其早期表达对于软骨和骨骼的进一步发育至关重要。虽然它在软骨生长板的肥大软骨细胞中受到抑制，但在整个生命过程中，仍在健康关节软骨的永久软骨细胞中表达。SOX9是软骨形成所必需的，它确保软骨细胞谱系的定型，是促进细胞存活并转录激活许多软骨特异性结构成分和调节因子的基因。当SOX9基因本身或周围的基因杂合突变时会导致早期致死性的人类骨骼畸形综合征(campomelic dysplasia,CMPD)[6]，因此全世界的研究人员都在努力研究SOX9在软骨形成中的许多作用和调控。SOX9发挥其功能并受到其分子基因RNA和蛋白质水平等的调节，因此文章将不同水平对于SOX9调控以及其对软骨细胞分化的影响进行综述和展望。
1 、资料和方法Data and methods
1.1 、文献检索与筛选要求
应用计算机检索CNKI、Pub Med、万方医学数据库建库至2020年12月收录的有关软骨细胞和SOX9调控相关文献，中文关键词为“软骨，软骨细胞，SOX9基因表达调控，转录后调控，蛋白质加工，翻译后修饰，功能伙伴”；英文关键词为“Cartilage,chondrocyte,posttranscriptional regulation,posttranslational modification,SOX9,transcriptional regulation,Gene Expression Regulation,SOX9 Transcription Factor/genetics”，进行全文检索。
1.2、 纳入与排除标准
纳入标准：(1)在软骨细胞谱系中依靠SOX9作用和调控的相关研究；(2)入选文献摘要内容与SOX9调控、软骨细胞高度相关；(3)文献类型为近5年发表的期刊论文、学位论文、综述及经典文献。
排除标准：(1)与此次综述相关性不强的文献；(2)重复发表、内容陈旧的文献；(3)无法进行详细资料和数据提供的文献。
1.3 、数据提取
以前文关键词分别组合检索，共检索到文献234篇，排除与研究无关及内容陈旧、重复的文献，最终纳入符合标准的61篇文献进行综述。文献检索流程图见图1。
2 、结果Results
2.1、 SOX9的特点
由于发现SOX9与骨骼畸形综合征之间的联系，这引发了大量学者对其的研究工作。研究表明SOX9在发育软骨中从成骨祖细胞阶段表达，并在软骨细胞中表达，SOX9对确保成人关节软骨的维持和功能至关重要；SOX9是软骨细胞分化的基础，通过转录激活许多建立和维持健康软骨所必需的基因，并至少部分通过非转录作用因子和有利于非软骨细胞谱系的途径抑制软骨细胞分化；SOX9在其基因RNA和蛋白质水平上的调控涉及多种调控机制；这些机制的改变可能是已检测到的SOX9水平改变的基础，并可能显着导致骨骼畸形和变性疾病。
2.2、 SOX9在不同调控水平对软骨细胞分化调控机制
从SOX9的发现到研究越来越细化，与其密切相关参与软骨细胞分化调控的信号传导途径包括wnt/β-catenin、转化生长因子β、骨形态发生蛋白和PKA等[7,8,9,10]；正转录调节因子包括Runx、Fox家族等[11]。通过了解目前在不同水平分析SOX9作用机制的现状，从而了解其与软骨疾病的联系。
2.3 、SOX9调控的分子途径
多年来，多个团队使用不同的方法进行的结构和功能研究都认为，SOX9作为转录激活因子可以发挥其关键软骨生成功能的大部分功能。用于染色质免疫沉淀的全基因组高通量测序测定法是对传统探测一个基因的DNA结合、报告基因和其他体外测定法的补充[5,12]。如CHENG等[13]研究表明SOX9直接靶向编码关键软骨特异性细胞外基质成分例如Ⅱ型胶原，或者是这些成分的调节剂(例如软骨素4的基因——磺基转移酶)，以及软骨中的关键信号传导介质(例如成纤维细胞生长因子受体3)。染色质免疫沉淀实验和补充研究表明了SOX9结合了数千个基因内和周围的增强子，这些基因中的许多基因不是由于一个或几个SOX9结合的增强子，而是由于它们在软骨中的特异性和高表达，是SOX9结合的增强子簇。TAKIMOTO等[14]研究发现Aggrecan(Acan)基因(UE)上游10 kb的先前鉴定的增强子可以在体内驱动软骨特异性报告基因的表达。旁系转录因子PAX1和PAX9差异地驱动UE。在发育中的脊柱中，PAX1/9与SOX9/5/6在椎间质和纤维环中共表达，PAX1沉默的纤维环细胞软骨化过程中观察到Acan显着上调，而软骨中PAX1的持续表达显着下调了Acan。在UE中PAX1/9,SOX9和SOX5/6的协同作用有区别地调节UE的反激活。MERKES等[15]研究发现斑马鱼中EWS(尤因肉瘤断点区域)的直系同源物Ewsa与软骨形成的主要转录因子SOX9相互作用，Ewsa与SOX9靶基因ctgfa和ctgfb基因座结合，Ctgf蛋白在ewsa/ewsa突变体的Meckel软骨中上调，因此Ewsa可以通过抑制ctgf基因启动子的SOX9结合位点促进从Meckel软骨的肥大性软骨细胞向肥大性软骨细胞的分化。由于尤因肉瘤在软骨细胞起源的骨骼组织中特异性发育，因此EWS的这一新作用可能为其发病机制提供了潜在的分子基础。OHBA等[5,12]研究发现SOX9通过在成对的DNA识别位点对上彼此同源并被3或4个核苷酸隔开而直接与软骨细胞基因组中的增强子结合。此外，一小部分SOX9基因组接触发生在广泛表达基因的近端启动子中，但没有SOX9特异性DNA识别位点。因此，这些接触被认为涉及SOX9与基础转录机制而不是与DNA的相互作用，它们的功能结果可能是增强这些原本不依赖SOX9的基因的表达。SOX9的确可以在不同的细胞分化阶段和不同的软骨类型中作用于不同的基因和不同的增强子，以解释不同的基因表达谱。
除了作为有效的转录激活因子外，SOX9还具有其他转录活性，其中之一是抑制不需要的基因，例如非软骨细胞或软骨细胞在不同分化阶段的标记基因。但是，迄今为止的关于染色质免疫沉淀研究发现，SOX9与活性增强剂和启动子有很强的联系，但与呈现转录抑制标记的基因组区域却没有强大的联系。因此，目前倾向于使用间接机制，例如转录阻遏物的SOX9激活。ZARET等[16]提出软骨细胞中针对SOX9提出的另一种转录活性是先驱因子的活性，即一种结合浓缩的染色质并诱导软骨细胞分化时启动软骨特异性基因进行反式激活所必需的表观遗传修饰的因子。该假设基于SOX9明确规定和维持软骨细胞谱系命运的绝对要求，但是，尚需提供结论性数据来证明SOX9是否以及如何成为软骨形成的先驱因子。SOX9在软骨细胞中具有关键的非转录作用，例如，在骨骼生成开始时，间充质干细胞中SOX9和β-catenin之间的竞争对于确定软骨细胞和非软骨细胞的命运至关重要。SOX9还可以与RUNX2相互作用，从而抑制该RUNT域转录因子在驱动软骨细胞末端成熟和成骨细胞分化中的关键作用[17]。这些非转录机制可以解释SOX9的某些抑制活性。
总之，SOX9在软骨细胞中具有关键的转录作用，既可以作为软骨特异性基因的激活剂，也可以作为先驱和阻遏物。由于SOX9与其他主要软骨形成调节剂一起在上游起作用，是软骨生成所必需的，因此被称为“主要软骨生成因子”。
2.4、 SOX9基因水平的调控
由于SOX9在软骨细胞中表现出的高度继发性活性，表明SOX9是许多类型调控机制的主题，并且有许多文献证明此观点。基因表达显然是SOX9调控的第一级，这也是关键之一。SOX9似乎受上游、下游和启动子顺式作用元件的控制，这些元件总共分布在多达3 Mb的基因组DNA上。即SOX9是模块化控制的，并且增强子的变体可能有助于人类个体以及脊椎动物物种之间的骨骼模式多样性。到目前为止，基于组蛋白修饰标记和报道基因在转基因胚胎中的活性，已经提出了几种SOX9的远程增强子[18,19]。这些增强子的基因组缺失与否在将来的研究中将是必要的，以评估每种增强子对SOX9表达的实际贡献。除了确定SOX9增强子外，更重要的任务是找到与这些增强子结合并平衡、激活或抑制SOX9表达的因子。LIU等[20]研究认为SOX5和SOX6是密切相关的DNA结合蛋白，可显着增强其功能。SOX蛋白靶向作用于增强子，会与细胞中超级增强子(SE)上的多个位点结合。这些超级增强子主要与软骨特异性基因相关，SOX蛋白有效地协同工作以激活这些超级增强子，并且在体内表达其相关基因。这些基因编码关键的调节因子包括SOX三重蛋白和所有必需的软骨细胞外基质成分。因此，SOX9和SOX5/SOX6主要通过超级增强子在全基因组范围内合作，以实现生长板软骨细胞分化程序。SOX9基因表现出高度特异性的表达，例如在软骨细胞等中富含SOX9 RNA，而在其他细胞类型中则无法检测到。此外，SOX9的表达必须严格定量控制，这一点证明了SOX9单倍体功能不足会导致严重的骨骼畸形综合征。
软骨形成取决于生长因子和其他生物物理或生化因素介导的众多信号通路的相互作用。因此，许多途径会在此过程中影响SOX9的表达，如SHI等[21]研究发现骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子信号组合增加了SOX9基因的表达和蛋白质生成，可以启动和维持软骨形成过程中SOX9的表达，并且SOX9组合式以复杂的方式调节生长因子的作用。秦胜男等[22]用外力作用于分离的大鼠肌腱干细胞，发现机械拉伸抑制了SOX9的表达，但机械拉伸作用消失后，SOX9表达上升，机械拉伸抑制作用可能刺激了SOX9的表达。ZHOU等[23]发现低氧诱导因子1α在体外能增强骨形态发生蛋白诱导的SOX9表达和下游标记的软骨形成表达，并能抑制Runx2表达和下游标记的成骨表达。在皮下干细胞植入研究中，低氧诱导因子1α被证明可增强骨形态发生蛋白诱导的软骨形成并抑制异位骨/软骨形成过程中的软骨内骨化。低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白协同促进增殖的软骨细胞区的扩张，并抑制软骨细胞肥大和软骨内骨化。当低氧诱导因子1α与骨形态发生蛋白结合时，诱导的间充质干细胞分化可能成为在软骨组织工程中维持软骨表型的新方法。ZHOU等[24]研究发现当成纤维细胞生长因子受体3发生突变时，可以导致软骨发育不全。每个信号传导途径在功能上依赖于一系列细胞内介体，其中转录因子直接在基因组水平上影响其作用。ASHRAF等[25]研究发现骨骼中富集的RAS同源基因，通过调节衰老、去分化和氧化应激来维持软骨细胞的先天特性，从而导致SOX9上调Ⅱ型胶原表达，并通过MCL1下调p27表达。其表达代表了一种潜在的有用机制，该机制可以通过调节衰老、去分化和氧化应激来保持软骨细胞的表型和分子特性。
ELDRIDGE等[26]研究发现在其他组织中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖通过与α-营养不良聚糖结合而将细胞骨架连接至基底膜。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白4结合，是神经肌肉突触形成所必需的，其在骨关节炎含量明显减少，因此外源性的凝集素可以通过结合低密度脂蛋白受体相关蛋白4及α-营养不良聚糖强烈促进体内软骨细胞分化和软骨形成。ZHANG等[27]用5-氮杂胞苷(DNA甲基化的抑制剂)对小鼠的关节软骨细胞进行处理，通过降低SOX9启动子区域的DNA甲基化水平来提高关节软骨细胞中SOX9的表达水平。结果表明，小鼠关节软骨细胞中SOX9的表达在关节发育完成后显着降低，表明SOX9表达受到DNA甲基化和组蛋白甲基化的动态调节。TILLGREN等[28]发现胶原相关的富含亮氨酸的小蛋白家族，软骨样钙蛋白的组织特异性表达和功能，主要在骨骼组织中，尤其是在胎儿软骨和成年软骨细胞中表达。重组软骨样钙蛋白结合细胞培养物中的胶原蛋白，并抑制体外胶原蛋白原纤维形成，并调节软骨细胞分化。软骨样钙蛋白可能具有负调控作用，确保形成稳定的细胞外基质。CHAVEZ等[29]研究发现3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸合酶2作为软骨细胞中转化生长因子β的转录靶标，软骨中蛋白聚糖的适当硫酸化需要3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸合酶2。SOX9是完整的转化生长因子β介导的3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸合酶2诱导所必需的，转化生长因子β处理表达SOX9的细胞导致3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸合酶2 mRNA的增强上调。用转化生长因子β处理后，SOX9蛋白在翻译后稳定。为软骨细胞中转化生长因子β介导的基因调控提供了新的机制。
MOCHIZUKI等[30]研究发现SIN3A-dCas9介导产生表观遗传沉默以及增强子的小鼠，可以确定一个关键的上游顺式元件和许多细胞因子及生长因子途径作为反式作用因子，调节软骨特异性SOX9表达和随后的骨骼发育，这有助于揭示详细的染色质构象和调控。KOUR等[31]发现由活化T细胞分泌的细胞因子白细胞介素3增加了小鼠软骨细胞特异性基因SOX9和Ⅱa型胶原的表达；白细胞介素3下调了小鼠和人软骨细胞中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α诱导的基质金属蛋白酶表达，以及减少了人骨性关节炎小鼠模型中关节软骨和软骨下骨微结构的退化，说明白细胞介素3具有改善与骨关节炎相关的关节软骨和软骨下骨微结构变性的治疗潜力。LIANG等[32]在检测软骨特异性基因和生长素释放肽受体、生长激素促分泌素受体的表达时发现：青少年特发性脊柱侧弯患者中的胶原蛋白Ⅱ，SOX9和生长激素促分泌素受体的mRNA和蛋白质水平升高；此外，生长激素促分泌素受体下游信号通路成员p-STAT3和p-ERK1/2的蛋白水平升高；在ERK1/2磷酸化抑制剂处理后，ERK1/2和STAT3的磷酸化同时被抑制，表明ERK1/2是STAT3的上游途径蛋白。生长素释放肽通过激活ERK/STAT3信号通路在上调青少年特发性脊柱侧弯患者软骨细胞的软骨特异性基因中起重要作用。
由于不编码蛋白质，长非编码核糖核酸(LncRNA)一直被认为是基因转录的干扰因子，并未受到重视。LncRNA是指长度超过200个核苷酸的一类核糖核酸，是最近发现的一类分子[33]。LncRNA在没有开放阅读框的真核生物中发现[34]，可以通过顺式或反式作用对基因表达产生深远影响。BARTER等[35]检测了小鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化和肥大分化过程中SOX9基因座上游的LncRNA和miRNA的表达谱。通过分析表明，这些LncRNAs与溶酶体之间有很强的相关性，LncRNA可能通过调控溶酶体的功能来调节细胞代谢，进而调控软骨的形成。而3种LncRNA(Gm6166、Gm14328和Gm13998)被干扰可以使软骨细胞肥大相关基因Runx2和Col10a1表达下降，提示3种LncRNAs均可促进软骨细胞肥大。因此LncRNAs在软骨形成和软骨细胞肥大的调控中起着关键作用，并且可能成为骨髓间充质干细胞在软骨组织工程和关节炎治疗中应用的潜在基因靶点。
2.5、 SOX9 mRNA水平的调控
TENDULKAR等[36]研究通过将合成的Link N肽(一种用于椎间盘修复的新型合成代谢刺激剂)编码mRNA传递到原代人软骨细胞和间充质基质细胞中，合成的修饰Link N肽mRNA有效地传递到两种细胞类型中，并且细胞转染导致聚集蛋白聚糖、SOX9和Ⅱ型胶原蛋白的表达增强，而X型胶原蛋白的表达降低。Link N肽mRNA向细胞的外源传递增强了合成代谢反应，从而增加了细胞外基质的合成，该方法可为关节软骨和椎间盘再生提供有效的策略。ZHANG等[37]研究用不同浓度骨形态发生蛋白7处理接种在多孔钽中的软骨细胞，发现经过适宜浓度的骨形态发生蛋白7处理后软骨细胞的糖胺聚糖量明显增高，软骨细胞中Ⅱ型胶原，聚集蛋白聚糖和SOX9mRNA的表达上调，表明骨形态发生蛋白7/钽/软骨细胞复合物能显着增强体外软骨细胞的增殖和细胞外基质，并能促进软骨细胞基因的表达。SOX9 mRNA在生理条件下不会进行差异剪接或细胞内定位，但是有证据表明它可以被microRNA靶向作用，即微小的(约20个核苷酸)非编码RNA。非编码RNA是指一组不能翻译成蛋白质的RNA，包括小核RNAs、小核仁RNAs、microRNAs(MiRNAs)和lncRNAs[38]。研究发现这些非编码RNA在表观遗传水平、转录水平和转录后水平上调控基因表达，并参与几乎所有的生理和病理过程[39,40,41]。CHEN等[42]发现MiRNAs特异性地结合到目标mRNA的3‘非翻译区(3’UTR)，以在转录后水平调节基因的表达。CHEN等[43]研究发现miR-455-3p在增生和肥大前软骨细胞中高表达，而组蛋白脱乙酰基酶2/8主要在肥大的软骨细胞中表达；同时，miR-455-3p抑制了包含在人SW1353软骨样细胞样胶原2启动子上的组蛋白脱乙酰基酶2/8的3’-非翻译区的报告基因构建物的活性，抑制了组蛋白脱乙酰基酶2/8的表达并促进了组蛋白H3乙酰化。组蛋白脱乙酰基酶抑制剂曲古抑菌素A的治疗导致软骨特异性基因表达增加，并促进糖胺聚糖沉积。此外，曲古抑菌素A抑制了基质金属蛋白酶13的表达并促进了白细胞介素1处理的原代小鼠软骨细胞中SOX9的核易位；敲除组蛋白脱乙酰基酶2/3/8增加了SOX9的表达，并降低了RUNX2的表达。这些发现表明miR-455-3p通过直接靶向组蛋白脱乙酰基酶2/8并促进组蛋白H3乙酰化而在软骨形成过程中发挥关键作用，这增加了使用miR-455-3p影响软骨形成和软骨变性的可能性。HOU等[44]对白细胞介素1β刺激的原代人和小鼠软骨细胞以及ATDC5衍生的软骨细胞中miR-381的表达进行了评估，研究miR-381对软骨形成和核因子kB信号传导的影响，使用siRNA或SOX9和Runx2的过表达质粒探测miR381的上游调节子，发现软骨和肥大性ATDC5细胞中miR-381的表达升高，Runx2或SOX9的过表达增加了ATDC5细胞中miR-381的表达。而miR-381抑制Ⅱ型胶原蛋白的表达，并增强金属蛋白酶13的表达，但不调节核因子κB抑制因子NFKBIA和NKRF活性。因此miR-381在软骨形成和关节炎软骨中高表达。它可能通过抑制Ⅱ型胶原蛋白并诱导基质金属蛋白酶13促进软骨基质的吸收。YU等[45]定量检测骨关节炎患者和非骨关节炎患者滑膜中miR-17-92簇成员的表达，评估了转录因子SOX9的表达和核因子kB途径的活性，发现与非骨关节炎相比，骨关节炎患者滑膜中miR-19a和其他5个miR-17-92簇的水平下调；miR-19a的过表达促进软骨细胞的活力和迁移；而miR-19a的抑制作用促进细胞凋亡，并抑制细胞的活力和迁移。miR-19a直接上调SOX9的表达，从而影响细胞活力和迁移，表明miR-19a可以通过核因子κB信号通路正调控SOX9的表达，从而促进软骨细胞的活力和迁移。该研究可能为软骨细胞功能退化引起的骨关节炎提供新的临床治疗策略。XU等[46]研究发现miR-27b表达在关节软骨增生区减少，但氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达增加，miR-27b的过表达抑制了氧化物酶体增殖物激活受体γ2以及X型胶原和基质金属蛋白酶13的表达；同时显着促进SOX9和Ⅱ型胶原在mRNA和蛋白质水平上的表达；siRNA介导的氧化物酶体增殖物激活受体γ2的敲低导致X型胶原蛋白质水平增加。表明miR-27b部分通过靶向氧化物酶体增殖物激活受体γ2调节软骨细胞肥大，并且可能在软骨疾病中具有重要的治疗意义。因此，需要进行进一步的研究发现直接影响SOX9 RNA水平或翻译的miRNA，以及通过结合其靶基因RNA间接对抗SOX9活性的miRNA。
2.6、 SOX9蛋白质水平调控
2.6.1、 磷酸化
SOX9的成软骨活性不仅取决于功能伙伴的可用性和蛋白质的完整性，还取决于翻译后的修饰。因此多种磷酸化会影响许多类型的蛋白质，包括SOX蛋白质。CORICOR等[47]研究发现转化生长因子β可以通过Smad介导不同途径(包括p38)发出信号，用转化生长因子β处理后，两种途径均在软骨细胞中被激活，并且转化生长因子β稳定了SOX9蛋白并增加了SOX9的磷酸化，p38和Smad3独立调节SOX9的磷酸化和稳定性。表明通过p38以及SOX9的磷酸化和稳定作用，转化生长因子β调节SOX9可能确定骨关节炎的治疗靶标。Yes相关蛋白1(YAP1)是Hippo途径的转录共激活因子和负调控因子，它调节多种细胞过程。CHEN等[48]研究发现白细胞介素6可以通过髓核细胞(NP细胞)中的酪氨酸磷酸化激活YAP1,YAP1的过表达降低了SOX9、Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达，而增加了基质金属蛋白酶13的水平，白细胞介素6增强了YAP1和β-catenin的相互作用以及核积累。IEZAKI等[49]研究发现Erk5直接在Thr249处磷酸化并激活Smurf2(泛素E3连接酶)，从而促进Smad蛋白的蛋白酶体降解并在Ser206的Smad206处磷酸化Smad1,Smads转录激活间充质细胞中SOX9的表达。这些发现突出了Mek5-Erk5-Smurf-Smad-SOX9轴在哺乳动物骨骼形成中的重要性。WU等[50]研究发现脂肪源性干细胞软骨形成过程中透明质酸羟基磷灰石的重均分子质量、CD44簇和细胞外信号调节激酶(ERK)/SOX-9途径之间的关系，分离和扩展的大鼠脂肪干细胞显示出多谱系潜力和不依赖锚定的生长特性，细胞聚集、软骨生成基因表达和硫酸糖胺多糖(s GAG)沉积随着大鼠脂肪干细胞中羟基磷灰石重均分子质量的增加而增加；更高的羟基磷灰石重均分子质量进一步增强了人脂肪间充质干细胞中的CD44聚集、ERK磷酸化以及SOX9表达和磷酸化。其结果表明不同分子质量的羟基磷灰石对脂肪干细胞的软骨形成影响不同，羟基磷灰石大小可以通过CD44/ERK/SOX9途径调节脂肪干细胞软骨形成。该发现提供了关于通过羟基磷灰石底物对软骨发生的生化控制的新信息，这可能为基于关节软骨再生的基于羟基磷灰石的生物材料的开发增加价值。
2.6.2、 甲基化、乙酰化和泛素化
前人的研究揭示了染色质修饰酶(包括组蛋白甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶和脱乙酰基酶)对表观遗传修饰的重要性，这对确定基因调控和细胞命运至关重要。同时，已经清楚的是这些酶靶向作用于非组蛋白，即转录因子，导致蛋白质水平和活性的改变。WANG等[51]将KDM6A shRNA转染到牙周膜干细胞。发现敲除KDM6A后，牙周膜干细胞中蛋白聚糖的产生减少；枯竭KDM6A抑制SOX9并导致H3K27me3增加和H3K4me3水平降低；EZH2抑制剂通过调节H3K27me3挽救了KDM6A后，挽救了牙周膜干细胞的成软骨潜力；通过H3K27me3的去甲基化作用，牙周膜干细胞的软骨形成分化需要KDM6A，而EZH2抑制剂可在敲除KDM6A后挽救牙周膜干细胞的软骨形成；KDM6A的上调或EZH2抑制剂的应用可能改善间质干细胞介导的软骨在炎症性组织破坏(如骨关节炎)中的再生。BAR等[52]研究发现SOX9在三维藻酸盐微珠培养物中被低乙酰化，并显示出与10 kb ACAN增强子的结合增强，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的Ⅲ类蛋白质脱乙酰酶SIRTUIN 1(SIRT1)是负责SOX9脱乙酰基作用的主要脱乙酰基酶。脱乙酰基促进SOX9核易位，能够在体外使SOX9脱乙酰化，从而促进ACAN和COL2A1的活化。Shohat型脊柱横突发育不良(SEMD)是影响软骨发育的骨骼发育异常，但其致病基因尚不清楚。EGUNSOLA等[53]发现在斑马鱼中，ddrgk1[包含1(DDRGK1)的DDRGK域]缺乏症破坏了颅面软骨的发育，并降低了软骨形成主转录因子SOX9及其下游靶标COL2A1的水平。DDRGK1丢失会降低SOX9的表达并引起人体骨骼发育异常，其可以直接与SOX9结合以抑制其泛素化和蛋白酶体降解来调节软骨形成的机制。KO等[54]发现在体外伴侣蛋白家族的成员热休克蛋白60信号传导的获得抵消了白细胞介素1β介导的线粒体生物生成，软骨转录因子SOX9和人软骨细胞培养物软骨基质表达的抑制。过度表达人热休克蛋白60的转基因小鼠具有更高的软骨细胞增殖能力和更厚的关节软骨。热休克蛋白60的过表达也减轻了关节损伤内软骨损伤及滑膜过度血管形成和巨噬细胞浸润的组织病理学变化。关节内给予外源性热休克蛋白60可改善软骨恶化、滑膜炎和骨赘堆积的发病机制，从而改善胶原酶损伤膝盖的步态。热休克蛋白60信号传导通过减弱受影响关节的SOX9超泛素化来维持SOX9的水平。
2.7、 SOX9的功能伙伴
SOX9蛋白调节主要是通过与其他蛋白质的物理和功能相互作用实现的。转录因子即与基因组增强子序列结合并与锚定在基因启动子上的基础转录机制相互作用的蛋白质复合物，通常在增强子中起作用。SOX9是软骨细胞自身的伴侣，许多其他蛋白质可能与SOX9一起参与软骨细胞增强体，它们包括SOX5和SOX6，这两个SOX家族成员与SOX9在软骨细胞中共表达。SOX5和SOX6是密切相关的DNA结合蛋白，体内功能丧失的实验表明，它们在软骨细胞谱系中起作用是增强SOX9分化软骨细胞的能力；功能获得实验表明，SOX5/SOX6和SOX9形成三元组，通常被称为软骨生成SOX三元组。Chst11,Fgfr3,Runx2和Runx3是新确定的SOX三元组。SOX9和SOX5/SOX6主要通过超级增强子在全基因组范围内合作，以实现生长板软骨细胞分化程序[20]，这对于在体外和体内促进间充质祖细胞的软骨细胞分化是必不可少的。ZHOU等[55]研究确定了转录因子ZNF606作为细胞中SOX9的相互作用伴侣，ZNF606的过表达抑制了SOX9的转录活性，而ZNF606的敲低则增加了SOX9介导的转录。因此，ZNF606抑制软骨细胞分化，充当了抑制SOX9介导的软骨细胞分化的新型SOX9共调节剂。软骨细胞其分化过程中可形成聚合体，有研究提出软骨分化过程中聚合体的形成可作为成软骨分化的一种形态学检测指标[56]。ZHOU等[57]研究发现软骨细胞特异性Zbtb20(锌指蛋白)基因敲除小鼠会出现软骨内骨化延迟和产后生长迟缓。Zbtb20缺乏症由于增生区中Vegfa的表达减少，导致软骨血管化的延迟和肥大区的扩展。而SOX9是Vegfa表达的直接抑制剂，在Zbtb20缺陷型晚期肥厚区的mRNA和蛋白水平上都异位上调。此外，SOX9的敲除明显增加了Zbtb20缺陷型肥大软骨细胞中Vegfa的表达。旁分泌激素甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)及其受体Pth1r是软骨细胞增殖和肥大的关键配体。FISCHER等[58]研究了频率、脉冲持续时间对PTHrP作用的影响。而在脉冲过程中，用PTHrP处理，SOX9水平的下降可能会延缓软骨细胞的形成和肥大，PTHrP脉冲显示出增强间充质干细胞软骨形成和抑制肥大的巨大潜力，可能是通过胰岛素样生长因子和SOX9相关机制的优异平衡来实现的。因此，需要更多的研究来揭示在软骨细胞分化的所有步骤中直接参与掌握软骨形成以及SOX9的整套因素。
3 、总结与展望Conclusions and prospects
综上所述，到目前为止，SOX9在软骨细胞分化的多个步骤中的作用已经相当清楚，包括高度模块化的遗传调控、转录后和翻译后修饰，以及各种功能伙伴的作用。在转录起始水平，SOX9启动子包含关键的如低氧诱导因子1α等顺式作用元件对SOX9基因的表达起着正性或者负性调节作用，前文中的miR-455、miR-381等这些miRNAs与SOX9相互作用来调节SOX9mRNA合成蛋白质，只有位于细胞核内，SOX9才能发挥转录因子的作用，SOX9的磷酸化可调节其DNA结合活性和亚细胞定位。SOX分子网络可能比目前所认识的要复杂得多。未来的重要目标是继续剖析SOX9调控的许多细节。通过使用体外和体内的不同方法，例如CRISPR/Cas介导的基因组编辑，对SOX9的转录和顺式作用区域、其靶标、辅助因子和调节因子进行基因修饰。新的发现有望对许多基础科学领域具有洞察力，有助于更好地掌握大量软骨疾病的潜在机制，并设计出更好的治疗这些疾病的策略[59,60]。如吴张松等[61]研究发现经诱导分化，诱导多能干细胞来源软骨细胞SOX9的表达量明显上升，修复效果明显好于诱导多能干细胞。SOX9功能和表达在开发过程中的细微变化可能会对软骨衰老和生命后期的磨损产生深远影响。在对SOX9及其对软骨细胞调控进行探究后，在已经获得的知识和有前途的新技术的基础上，在预防/治疗和治愈软骨疾病方面将会出现新的方法。
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