摘 要： 上皮生长因子受体 (EGFR) 是上皮生长因子 (EGF) 细胞增殖和信号传导的受体, 在增殖和迁移等基本细胞功能中起着关键作用。已经有大量的研究对配体刺激的EGFR信号转导的分子机制进行了分析, 但这些研究主要集中在EGFR转运失调导致的促有丝分裂的信号转导通路, 对EGFR内吞转运机制的途径阐述得仍不透彻。本篇综述主要对EGFR内化过程中的不同内吞转运途径及其涉及到的分子机制进行了总结。
关键词： 上皮生长因子; 内吞; 转运;
上皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 是一种分子量为1.7×106的跨膜糖蛋白, 属于酪氨酸激酶受体, 是Erb B家族信号受体的成员之一。EGFR也被称作HER1、Erb B1, 主要分布在细胞膜表面, 由胞外配体结构域、跨膜区和胞内酪氨酸激酶结构域3部分组成。EGFR能够参与多种信号通路, 在生长发育中起到重要作用, 它的过表达或突变通常会引发机体癌变。当EGFR通过内吞内化进入细胞后, 则会阻碍信号通路的传递。有研究发现在EGFR无法发生内吞的细胞中, 上皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) 的刺激能够增强有丝分裂信号转导和细胞增殖[1], 这也证明了EGFR的内吞与其信号传导之间确实存在着某种联系。而本文关注的焦点在于EGFR内吞的不同转运途径及其涉及到的分子机制。
1、 EGFR的内化
EGFR通常与配体结合发生活化, 通过网格蛋白介导的途径和不依赖网格蛋白途径的多种途径进行内吞转运。迄今为止已经发现了EGF、转化生长因子 (transforming growth factor-α, TGF-α) 、肝素结合EGF样生长因子 (heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF) 、β细胞因子 (betacelluin, BTC) 、双调蛋白 (amphiregulin, AR) 、上皮调节蛋白 (epiregulin, EPI) 、epigen和neuregulin2-β等8种EGFR配体[2]。EGFR与配体结合后, 其胞外结构域的构象发生变化, 导致EGFR二聚化并使其活化[3]。有研究发现未结合配体的EGFR也可以发生内化, 但其内化速率明显要慢于结合了配体的EGFR[4]。在不结合配体的情况下, EGFR也会表现出在单体和二聚体之间波动, 但结合配体似乎是EGFR信号转导的必需条件[5]。
2、 网格蛋白介导的内吞途径
网格蛋白 (clathrin) 是具有3条重链的三聚体, 主要参与质膜的内吞[6]。有研究表明, 干扰网格蛋白的重链能够抑制EGFR的内吞[7-8]。因此EGFR的主要内化途径可能是网格蛋白介导的内吞途径 (clathrin-mediated endocytosis, CME) 。研究发现当EGF处于低浓度时能够观察到CME特征的高内化率, 而EGF的摄取率会随着EGF浓度的增加而降低[9]。这个发现表明EGFR的内化速率也会依赖EGF的浓度, 同时在这个过程中也可能会出现饱和的情况, 又或者是由于细胞表面存在过多的复合物限制了CME对EGF的摄取[10]。还有研究称EGFR的内吞过程中网格蛋白衔接蛋白复合物 (adapter protein-2, AP-2) 也参与其中, 但由于siRNA沉默AP-2的表达后并没有影响EGFR内化, 因此AP-2的作用仍有争议[7,11]。已经证实EGFR和AP-2的μ2亚基之间存在相互作用[12]。而EGF刺激后, AP-2的β2亚基发生的酪氨酸磷酸化与EGFR羧基末端的di-亮氨酸模体有关[13]。然而该模体的突变只破坏了EGFR的靶向降解, 却并不影响EGFR的内吞作用。这表明EGFR di-亮氨酸模体或AP-2的β2磷酸化可能与促进下游分选机制的招募有关。上述研究表明虽然EGFR的内吞过程中并不一定需要AP-2的参与, 但它与EGFR的相互作用以及对内吞过程中的其他成分的招募可以促进内吞作用。
3、 非依赖网格蛋白的内吞途径
虽然CME是EGFR内吞最主要也是最高效的途径, 但也存在较慢且不依赖网格蛋白的内吞途径。
高浓度的EGF以依赖Epsin和Eps15的方式促进EGFR通过非依赖网格蛋白的内吞途径 (clathrinindependent endocytosis, CIE) 内化[14-15], 这种现象的发生可能与CME达到饱和有关。有研究用EGF处理A431细胞后导致质膜出现了大范围的褶皱, 同时在形成的微胞饮和巨胞饮囊泡中发现了标记的EGF, 而在这一过程中并没有检测到网格蛋白外壳[16]。这种EGF诱导的胞饮作用也可能由于A431细胞中EGFR的高水平表达。但在随后用高浓度EGF处理EGFR低表达的COS细胞时, 也观察到了缺乏网格蛋白参与的EGFR内化[17]。
EGF-EGFR复合物的内吞作用还涉及到脂筏和胞膜窖 (caveolae) [18]。胞膜窖作为质膜上的独立结构, 参与胆固醇转运、细胞内吞、细胞膜组装、信号转导和肿瘤生成等多种细胞活动。在海拉细胞中发现, 当大部分的EGFR被EGF占据时, 可以观察到依赖脂筏的内化方式;然而用菲律宾素 (filipin) 处理海拉细胞后并不影响EGFR的内化[2]。用EGF刺激海拉细胞后, EGFR可以与窖蛋白发生共定位, 这些结果表明EGFR的内化还可能存在依赖脂筏和窖蛋白的途径。然而后来有研究用siRNA沉默窖蛋白, 结果发现并不影响EGFR的内化[2]。因此, EGFR依赖胞膜窖和脂筏的内吞途径可能存在细胞特异性, 甚至在海拉细胞的不同亚克隆中都存在不同的影响。
生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor bound protein 2, Grb2) 即ASH蛋白, 其结构具有一个SH2和两个SH3结构域, 参与调节细胞内各种受体激活的下游信号转导。Grb2通过其SH2结构域结合并活化EGFR[18]。Cbl是主要的与Grb2相互作用的蛋白之一, 参与和调控了EGFR的内化和降解[16]。Cbl家族有3个成员, c-Cbl、Cbl-b、Cbl-3。前两种具有延伸的C末端, 其上具有能与SH3结构域结合的富脯氨酸模体[19]。Cbl作为泛素连接酶, 能够直接或间接地与活化的EGFR结合并使其泛素化, 从而调节受体在溶酶体中的靶向降解。不同的细胞类型中, Cbl与EGFR的相互作用可能具有不同的结果。有研究发现用EGF刺激后在网格蛋白的被膜小窝中检测到c-Cbl的存在[20]。而在海拉细胞、PAE和NIH3T3细胞 (表达内源性EGFR) 中也发现c-Cbl的突变抑制了EGFR的内化[21-22]。与此一致的是在Grb2缺陷的细胞中发现c-Cbl与Grb2的SH3结构域的结合能够缓解EGFR的内化[23], 而当用siRNA沉默c-Cbl和Cbl-b后, EGFR的内化被部分抑制[24]。
Cbl与EGFR第1045位磷酸化的酪氨酸的直接结合似乎没有在EGFR的内化中表现出重要作用, 而Grb2介导的与EGFR的相互作用才是关键[22]。有研究发现在PAE和海拉细胞中, 利用siRNA沉默Grb2后抑制了EGFR的内化[25]。这表明Grb2可能在EG-FR内化中起着重要作用。此外, 在被膜小窝中也发现了Grb2-EGFR的复合物, 这似乎也进一步说明了Grb2对EGFR内化的重要性。例如, 在L929细胞中, Grb2的沉默使得EGFR的内化率显着降低[16]。
值得注意的是, 网格蛋白的敲除并不能完全抑制HB-EGF和BTC诱导的EGFR内化, 这表明HB-EGF和BTC刺激可能是通过其他非网格蛋白依赖的途径诱导内化的[2]。但在单独的研究中发现, 即使在高浓度配体的作用下, 网格蛋白的消耗也会对EGFR的内吞存在抑制作用。这表明CIE对EGFR内吞作用的影响较弱[16]。总结来说, EGFR的内化涉及多种因素的组合, 是冗余和协同的。
4、 内吞后的EGFR分选
EGF与EGFR结合形成复合物后进入囊泡, 含有复合物的囊泡会释放外壳与早期内体分开, EGF-EG-FR复合物会在短时间内积累到早期内体并伴随着内体成熟分选到溶酶体或质膜。
EGFR进入内体后靶向溶酶体降解或者循环到细胞表面重新利用。这两条途径的进行微妙平衡了EGFR靶向溶酶体的降解途径过程中衰减的信号转导和EGFR再循环回到细胞表面过程中的持续的信号转导。
4.1、 EGFR泛素化和内吞体分选转运复合体介导的
分选
泛素化修饰对分选活化的EGFR起着重要作用[26]。泛素化的EGFR被包括内吞体分选转运复合体-0 (endosomal sorting complex required for transport0, ESCRT-0) 组分的肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物 (Hepatocyte growth factor-regu-lated tyrosine kinase substrate, Hrs) 、ESCRT-Ⅰ组分的肿瘤易感基因101 (Tsg101) 在内的泛素相互作用模体 (ubiquitin interacting motif, UIM) 识别, 然后通过ESCRT机制分选到成熟内体的内腔囊泡 (intraluminal vesicles, ILVs) 上, 去除活性激酶结构域, 靶向溶酶体进行降解。在EGF-EGFR复合物分选到ILVs前, 去泛素化酶 (ubiquitin-binding domains, DUB) 去除其结合的泛素, 而解离下来的泛素被循环利用以维持游离的泛素量。泛素化的EGFR与含有Hrs和信号转导衔接分子 (signal-transducing adapter molecules, STAM) 的ESCRT-0复合物存在相互作用。ESCRT-0复合物通过Hrs与PI3K的相互作用招募泛素化的EGFR聚集到内体, 同时ESCRT-0复合物的Hrs结构通过与ESCRT-I的Tsg101相互作用对ESCRT-I进行招募, ESCRT-I招募的ESCRT-Ⅱ可以激活ESCRT-Ⅲ复合物, 依赖ES-CRT-Ⅲ完成ILVs的分离和形成[1]。
4.2、 调节EGFR回收循环
现已证实了泛素化的EGFR在靶向降解中的重要作用, 但泛素化的EGFR突变体也被发现可以逃脱溶酶体的靶向降解, 循环回到质膜表面被重新利用[27]。由此看来EGFR的回收循环似乎是其逃脱靶向降解后的唯一去向, 而其相关效应物的确定也表明了这一观点。EGFR循环可以通过Rab4和Rab35的直接调节或依赖Rab11经由核周内吞回收室 (Endocytic recycling compartment, ERC) 的途径回到质膜。同时还有报道称钙调蛋白亲环蛋白配体 (calciummodulating cyclophilin ligand, CAML) 与激活的EGFR激酶结构域相关联, 促进EGF刺激的EGFR回收循环[28]。
影响EGFR内吞途径的其他因素还包括Hrs磷酸化和受体AMSH介导的去泛素化, 并且Hrs磷酸化和AMSH失活与EGFR再循环相关[29]。此外, 配体的激活也可以引导EGFR的转运, 这取决于配体-EG-FR之间相互作用的稳定性[1]。例如, EGF与EGFR结合, 通过内吞途径内化进入细胞, 经早期内体和晚期内体完成信号传递后, 通常靶向溶酶体降解或是再循环回到细胞表面再利用。而TGF-α与EGFR结合形成的复合物内化进入细胞后, 配体受到p H下降的影响与EGFR解离, 随后绝大部分EGFR循环回到细胞表面。配体HB-EGF和BTC的刺激会使内吞过程中的多数EGFR降解;配体AR刺激的内吞途径可能进入再循环途径, EGFR不容易回到细胞表面[2]。此外, EGFR不同的二聚体也会产生不同的影响。除同型二聚体外, EGFR还可与Erb B家族成员形成异源二聚体。而在EGF刺激下, EGFR同源二聚体被分选到溶酶体进行降解, 异源二聚体不能招募Cbl, 从而逃脱靶向降解, 进行回收利用。
5、 EGFR内化与肿瘤发生发展
EGFR的异常表达和转运失调在肿瘤的发生发展中起着重要作用。EGFR的过表达和特异性致癌突变导致受体自发二聚化, 引起受体的活化[30]。已经在肿瘤中发现缩短的EGFR突变体和激酶结构域突变的EGFR突变体是EGFR突变的两种主要类型, 两者都具有持续的活性[31]。在非小细胞肺癌中发现, 具有持续活性的EGFR致癌突变体转运到ERC, 与src具有高亲和性[32]。同时有研究发现这两种激酶能够一同转运, 并且它们的共定位促进了EGFR介导的信号转导[33]。然而非小细胞肺癌相关的EGFR突变体似乎在与Cbl的相互作用中受损, 致使其发生去泛素化和降解, 导致信号传导延长[34]。除此之外, 胶质母细胞瘤 (glioblastoma) 细胞中最常见的EGFRⅧ型突变体, 其胞外结构域缺失了267个氨基酸, 虽然不能结合配体, 但仍具有活性[35]。
某些致癌基因通过调节EGFR转运来行使其功能。鸟嘌呤核苷酸交换因子可以调节细胞黏附、运动、迁移和增殖, 以延长生长因子信号传导、延缓EG-FR内化和降解, 同时增强EGFR、ERK和AKT磷酸化水平[36]。活化的Cdc42结合蛋白激酶1 (activited Cdc42 kinase 1, ACK1) 是一种非酪氨酸激酶, 作为细胞分裂周期蛋白2下游的效应器参与了多条信号通路转导, 在增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用[37]。ACK1与泛素化的EGFR相互作用, 促进EGFR降解, 通过涉及Arp2/3调节蛋白、皮层蛋白磷酸化的机制, 潜在的提供了Arp2/3为基础的肌动蛋白动力学和EGFR靶向溶酶体的一种联系[38]。
6、 展望
EGFR与配体 (以EGF为主) 结合发生活化, 通过CME和CIE途径进入细胞并转运到早期内体和晚期内体, 经ILVs和ESCRT机制分选后靶向溶酶体降解或循环回到质膜表面重新利用。总之, EGFR的内化过程十分复杂, 它依赖于多种冗余机制[16]。通过对EGFR内吞转运机制的了解, 不仅增加了我们对EGFR与肿瘤发生发展的认识, 并且还可以从中找到新的治疗靶点。然而这其中仍有问题需要我们深入研究, 例如越来越多的证据表明放化疗反应中, 调控EGFR转运可增强常规放化疗耐药肿瘤的治疗效果, 而EGFR的信号传导似乎也对细胞存活和DNA修复起着重要作用。未来随着对EGFR内化途径及内吞后的转运调节机制研究的深入, 应激激活的EGFR转运途径和调节其转运分子机制的确定将有助于分析EGFR转运在调节DNA修复和细胞存活中的重要性, 并以此开发出新的针对诱导EGFR内化或胞内转运调节的药物治疗癌症。
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