骨代谢的平衡由骨形成和骨吸收维持，成骨细胞（OB） 和破骨细胞（OC） 起着重要作用。其中，OC是一种具有独特骨吸收功能的多核巨细胞，来源于造血细胞系，属于终末细胞，不能增殖和传代〔1〕。而破骨样细胞（OLC） 是指具有OC性质，通过原代培养或实验诱导生成的，用于实验研究的细胞。到目前为止，还没有成熟的OC株。自从Testa等〔2〕首次在体外培养骨髓造血细胞时发现能够形成OC后，骨髓诱导培养法分化OLC的技术形成并逐渐开展应用。获得OC的方法多种多样，包括诱导培养、直接培养等技术都逐渐趋于稳定成熟，有助于着手从基因水平深入研究骨吸收的机制，从而进一步开发代谢性骨病的治疗药物。本文拟证实慢病毒转染OLC的可行性，为进一步利用OLC进行基因学研究奠定重要基础。
1 材料与方法
1. 1实验动物4周龄雌性SD大鼠，购自吴氏实验动物中心。
1. 2主要试剂、材料和仪器 低糖DMEM培养基 （ 美国Hy-clone公司） ,中美胎牛血清（Bioind） ,红细胞裂解液，双抗、磷酸盐缓冲液 （PBS,美国Gibco公司） ,鼠M-CSF、RANKL（ 美 国Peprotech公司） ,抗酯酸性蛋白酶染色试剂盒（TRAP,美国Sig-ma公司） ,NFAT抑制剂 （ 德国Calbiochem公司 ） ,Trizol（ 美国Ambion公司） ,逆转录试剂盒（Ta KaRa） ,SYBR Green试剂（In-vitrogen） ,NFAT2RNAi慢病毒、对照病毒由厦门欣基公司包装合成，引物由上海生工公司合成；10 cm培养皿、六孔板（ 美国Corning公司） ;CO2培养箱（ 美国Thermo公司） ,DM2500荧光显微镜（ 德国Leica公司） ,PCR扩增仪（ 美国Bio-Rad公司） ,荧光定量PCR仪7500型（ 美国ABI公司）。
1. 3大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs） 的分离与诱导培养 取SD大鼠麻醉后处死，无菌条件下取双侧股骨和胫骨，剔除多余软组织，用5 ml注射器吸取适量低糖DMEM冲洗骨髓腔，直至骨髓腔 变 白，取 冲 洗 液 充 分 吹 打 制 成 细 胞 悬 液 后 离 心，800 r / min,3 min.弃上清加红细胞裂解液，混匀静置2 min,800 r / min离心3 min,弃上清去除红细胞，得到白细胞沉淀。重悬于含25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng/ml RANKL的低糖DMEM完全培养液（ 含10% FBS、1%青霉素与链霉素） ,接种于10 cm培养皿，37℃ 、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h.取未贴壁细胞，调整细胞密度为2. 5×105重悬于含25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng / ml RANKL（ 大鼠） 的低糖DMEM完全培养液，接种于六孔培养板，继续培养，首次半定量换液，以后每隔3 d换液。
1. 4慢病毒转染OLC并分组 以hela细胞（2. 5 ×104/孔） 对比，待获得的OLC生长融合达约60%时，对照病毒（ 无NFAT2沉默） 转染按感染复数（MOI）15、5、1各分为三组，18 h后首次换液，此后每2 ~ 3 d换液1次并于第5天观察荧光表达情况，荧光显微镜（×200） 下随机选取5个视野拍摄OLC和hela细胞，并用Image-Pro Plus专业图像分析软件计数。
1. 5 TRAP染色及计数 将OLC于转染后第5天弃培养基，PBS冲洗2遍，柠檬酸盐/丙酮固定液室温下固定30 s,用蒸馏水冲洗、晾干，按试剂盒说明书行TRAP染色，倒置相差显微镜（×200） 下随机选取5个视野计数3个核以上破骨细胞，并在200倍光镜下，用Image-Pro Plus专业图像分析软件计数。
1. 6 NFAT2抑制剂干预OLC将获得的OLC融合率达到60%左右时，进行不同干预并分为OLC对照组、NFAT2抑制剂（VIVIT） 组、NFAT2iRNA慢病毒组、对照病毒组。NFAT2iRNA慢病毒组和对照病毒组病毒剂量均以MOI = 15为参数，VIVIT试剂以2 μmol/L每孔连续干预3 d,此后每2 ~ 3 d换液1次并于第5天进行RT-PCR检测。
1. 7 RT-PCR检测 细胞总RNA用Trizol提取。取总RNA2 μg,按反转录试剂盒 （Ta KaRa） 步骤完成反转录。以GAPDH为内参照，取2 μl反转录产物分别以下述引物进行PCR扩增。引物序列及反应条件：①NFAT2: 顺向GGAGGGAAGAAGATG-GTGTTGT,反向CTGGTTATTCTCTGGTTGCGG;② GAPDH: 顺向AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,反向CGTTGAACTTGCCGTGGG-TAG; 反应条件：95℃ 30 s后，95℃ 5 s,60℃ 34 s,反复循环40次，95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s后结束反应。采用2-ΔCt的方法计算基因相对表达量，公式： 目的基因表达量= 2-ΔCt,ΔCt =Ct目的基因-Ct内参基因。
1. 8统计学方法 应用SPSS13. 0软件选用单因素方差分析（One-way ANOVA）、LSD方法统计。
2 结 果
2. 1细胞生长特性 倒置显微镜下观察，大鼠BMSCs培养24 h后开始贴壁，呈梭形，诱导后细胞逐渐变大，集落融合成多核破骨细胞，第9天时细胞状态最佳，数量最多，随后细胞开始皱缩，出现大量空泡。MOI = 15、5、1均未见明显的细胞毒性。见图1.
2. 2转染及计数 带有绿色荧光蛋白（GFP） 标记的对照病毒转染OLC后第5天在倒置荧光显微镜下观察，可见转染上的OLC发出较强的绿色荧光，胞体大、形态不一、核数≥3、细胞外围有一明显皱褶缘。随着MOI值的升高，hela的转染数增加，各组之间比较均有显着差异（P<0. 01）。OLC组在MOI = 15时，转染数最多，与MOI = 5、1比较有统计学差异（P<0. 01）。MOI = 15时，OLC褶皱缘明显、荧光强；MOI = 5、1时，转染的OLC荧光较弱，皱褶缘少，其他细胞转染较多。见图2,表1.
2. 3 TRAP染色及数量 诱导的OLC经TRAP染色后胞质深染呈紫红色，而胞核阴性，核数目≥3,多位于周边。经Image-Pro Plus计数分析后，MOI = 15组 （53. 60 ± 3. 65）、MOI = 5组（47. 20±3. 83）、MOI= 1组（48. 80±7. 12） 细胞数量均无显着差异（P>0. 05）。见图3.
2. 4 NFAT2iRNA慢病毒转染OLC后NFAT2的表达 不同病毒转染OLC后 荧 光 显 微 镜 下 观 察，与 对 照 病 毒 组 比 较，NFAT2iRNA慢病毒组OLC数目少，荧光强度弱，未见皱褶缘。经过不 同 干 预 后，NFAT2抑 制 剂 组 （0. 009 7 ± 0. 001 7） 和NFAT2iRNA慢病毒组（0. 009 6 ± 0. 002 0） 的NFAT2基因表达明显 低 于OLC对 照 组 （0. 015 8 ± 0. 002 6） 和 对 照 病 毒 组（0. 015 9±0. 002 5） （P<0. 05）。而OLC对照组和对照病毒组、NFAT2抑制剂组和NFAT2iRNA慢病毒组之间的NFAT2基因表达无显着差异（P>0. 05）。见图4.
3 讨 论
骨代谢疾病如骨质疏松、Paget病、牙周炎等病理变化都存在骨吸收异常，其中OC起重要作用〔3〕。OC在体外很脆弱，培养难度高，纯度不高。本实验将大鼠BMSC在体外培养过程中加25. 0 ng/ml M-CSF +50. 0 ng/ml RANKL进行诱导，获得一定量的成熟OLC,观察培养至第9天时数量最多，与其他培养方法比较，与体内OC生物学功能最接近〔4〕，最适合用于体外深入研究。
慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1） 为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久稳定的表达。在感染能力方面不同于腺病毒和逆转录病毒，可有效地感染一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化细胞等，适用于OC的体外研究〔5〕。GFP是一种新型报告基因，与目的基因构成融合基因后，通过载体（ 如质粒、慢病毒、腺病毒） 转染，细胞可表达GFP蛋白，产生绿色荧光。本实验发现慢病毒转染效果与MOI值有密切关系，随MOI值的增加而升高，TRAP染色进一步验证MOI = 15、5、1对细胞均无较明显毒性作用。
Ca2+/ NFATc1信号通路是OC内重要的信号系统，参与调节OC的分化和成熟〔6〕。活化T细胞核因子家族中的NFATc1已被证实是其中重要的转录调节因子，参与许多OC特异性基因的表达调控，对OC分化和骨吸收功能至关重要〔7〕。有研究表明，NFATc1基因敲除的小鼠表现为骨硬化症〔8〕； 其基因缺陷的胚胎干细胞不能分化成OC,但表达外源性NFATc1的前体细胞在没有RANKL的情况下也能向OC分化〔9〕。因此，可选择最适宜的MOI值用NFAT2iRNA慢病毒对OC进行基因验证。NFAT2iRNA慢病毒进入OC转染成功后使NFAT2基因沉默，表达下降，而对照病毒没有使NFAT2沉默的作用，同时加入VIVIT作为对照，VIVIT组和NFAT2iRNA慢病毒组的NFAT2基因表达明显低于OLC对照和对照病毒组，说明转染成功。此外，荧光显微镜也进一步证明NFAT2对OC的分化和成熟的重要性。
体外成功转染OC的主要措施： 保证转染前细胞活性处于最佳状态； 病毒转染前更换新培养基效果最好； 加病毒后一般需在8 ~ 12 h更换培养基。经过反复大量实验，发现对于OC18个小时为最佳换液时间； 采用1 ~ 2个月大鼠，所诱导的OC最多； 动物从处死到分离细胞速度要快，OC不易受损； 严格无菌操作，诱导因子足量； 采用差速贴壁法纯化OC,因所分离成纤维细胞等贴壁速度快，在培养24 h后收集未贴壁细胞接种至另一培养板中可提高纯度； 纯化后OC为更好贴壁，2 ~ 3 d内需要静置培养，不宜挪动。
综上所述，此次OC转染成功为今后骨代谢疾病的基因治疗开拓了广阔的道路，利用携带目的基因慢病毒载体转染OLC,研究骨吸收的具体分子机制及有关OC内分化的信号通路是今后进一步实验的方向。
4 参考文献
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