口腔是外界连接呼吸道、消化道的通道，为微生物的定植提供了适宜的温度、湿度和营养源，口腔内微生物的多样性有利于维持口腔，并抵御外界不良因素对机体的侵袭。一旦微生物群落失调，则可导致龋病、牙周病以及口腔溃疡等口腔疾病[1].微生物多样性研究是进行复杂微生态系分析的基础，通过分析口腔中微生物丰度与数量的变化，能够揭示口腔疾病发生与微生物群落之间的关系，并为其预防和治疗提供合理的理论依据。本文旨在通过对口腔微生物多样性研究技术进行综述，为相关领域的研究者提供参考。
传统的微生物多样性研究依赖于分离培养技术，通过对形态观察、生理生化特性及免疫血清分型对其进行鉴定。目前该方法已经非常成熟，但同时也存在较大的弊端，首先该方法费时费力，准确性较差；其次口腔中有相当一部分细菌在目前的技术条件下是难以培养的[2]; 另外，该方法也不能准确反映口腔中微生物种类和数目的真实组成情况。
分子生物学等相关技术的使用为微生物多样性研究提供了新的手段，不需要对细菌进行培养即可直接检测口腔中的微生物，能够较为真实地反映这些微生物的分布和组成情况。目前运用较多的手段是基于 PCR 扩增的指纹图谱技术，基于 DNA 文库的宏基因组技术以及基于高通量高灵敏度化学分析的代谢组技术等。
1 高通量指纹图谱技术
该技术是一类直接从微生物群落样本中提取核酸，通过特定基因的 PCR 扩增和电泳分离产生条带，以条带分布的亮度来分析微生物的组成及变化。
DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或不同群落之间的差异[3],其中最受关注的是变性梯度凝胶电泳技术。
1. 1 变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（ Dena-turinggradientgelelectrophoresis, DGGE ） 技术首先由Muyzer[4]引入到微生物生态学研究中，通过在凝胶中建立一定的变性梯度，使长度相同但碱基组成不同的 PCR 产物在不同的变性剂浓度处解链，从而改变迁移速度，不同的序列的微生物 DNA 片段分离开，形成条带各异的电泳图谱。从理论上分析，即使单个碱基的差异也可以造成迁移速度的改变，即使微小的序列差异，也可以被分离开。所以该技术在微生物群落的遗传多样性和种群差异研究方面具有明显的优越性。在进行 DGGE 分析时，一般选用16S rRNA 作为扩增目标，由于 16S rRNA 普遍存在于细菌基因中，且其保守性较高，具有种的特异性，所以电泳中的每一条电泳带即代表一种细菌，条带的灰度代表了该物种在群落中的丰度。另外，在电泳后还可以通过对特定的条带进行回收测序，从而确定该条带所代表细菌的种类，有助于研究者分析样品中具体的菌群组成。
目前，DGGE 技术在龋病发生、根管内感染的预防与治疗、牙周病以及口腔唾液微生物组成与口腔健康等方面均有应用。已有的研究表明，相较于传统培养技术及其他分子生物学方法，DGGE 在进行口腔微生物群落多样性研究时，能够更全面的反映相关样品中微生物群落的组成情况，具有极高的灵敏性，为揭示口腔疾病的发生以及口腔微生物的动态变化提供更为丰富的信息。
1. 2 其他指纹图谱技术 温度梯度凝胶电泳（ Tem-perature gradient gel electrophoresis,TGGE） 与 DGGE相似，只是在电泳过程中采用改变电泳温度的方法使不同序列的 DNA 分离。单链构象多态性技术（ Single-strand conformation polymorphism,SSCP） 也是对相同长度但序列不同的 PCR 产物进行电泳，电泳前事先使 DNA 变性形成单链，不同序列的单链DNA 能够形成特定的二级结构，在恒定的非变性电泳条件下被分离开来，该方法灵敏度较高，但由于无法预计不同单链 DNA 二级结构的电泳速度，所以很难控制电泳时间。
限制性酶切片段长度多态性（ Restriction fragmentlength polymorphism,RFLP） 技术、末端限制性片段长度多态技术（ Terminal restriction fragment length poly-morphism,T-RFLP ） 和扩增片段长度多态性技术（ Amplified restriction fragment polymorphism,AFLP） ,都是利用限制性内切酶对 DNA 进行酶切，酶切片段通过电泳形成特定的条带（ 图谱） ,其差异即体现样品微生物基因的多样性变化。其差异在于 RFLP 和T-RFLP 先对特定基因进行扩增 （ 以 16S rRNA 为主） ,再进行酶切； 而 AFLP 则是先进行酶切，再进行扩增。其中，T-RFLP 扩增的引物用荧光标记，电泳结果只显示带荧光的片段，荧光的亮度还能够反映相应细菌的丰度，而 RFLP 则是对所有酶切片段进行电泳。
核糖体基因间区分析（ Ribosoma lintergenic spac-er analysis,RISA） 也属于指纹图谱技术，根据不同种属细菌间的 16S 和 23S 核糖体基因间的间隔区序列的差异，对细菌进行亚分类研究。Kumar 等应用RISA 对数种新发现的慢性牙周病的可疑致病菌进行了种系鉴定[5].
传统的观点一般认为，龋病及根管内感染的发生往往是由于某类致病细菌造成的，但随着各种指纹图谱技术的应用，越来越多的研究显示，口腔疾病的发生，与口腔微生物多样性的改变有密切关系。
有学者分析了牙周炎患者口菌群的变化，发现治疗前后牙周袋内的菌群发生较大的改变，而且，培养数量最多的菌群并非口腔中的优势菌群[6].利用口腔中细菌的16S rRNA 可变区进行 DGGE 电泳，结果显示无龋病者口腔中的细菌种类明显多于患龋者[7],而在牙髓炎的致病菌分析方面的研究也显示，细菌群落的改变与其临床病征上的表现密切相关，而且不同患病个体之间，其群落组成既有差异又有关联[8].另外，利用 T-RFLP 分析评估口腔菌群的多样性， 能够对牙周炎的治疗效果进行评价[9],从而更好的指导医师用药。还有研究结果显示，在口腔疾病的治疗过程中，口腔微生物多样性发生较大的波动，这是传统方法所无法检测的。所以，指纹图谱技术的应用，能够更准确地分析口腔菌群的多样性，检测菌群的动态改变，从而为揭示疾病的发生机制以及治疗方案提供重要参考。
2 宏基因组技术
宏基因组是指生物环境中全部微小生物遗传物质的总和，由 Handelsman 最先提出。宏基因组技术也是直接从样品中提取生物 DNA,再将 DNA 裂解成合适的大小，然后插入到载体并导入合适的寄主形成文库，文库可以通过宿主的不断分裂而得以复制和扩增，然后以这些文库为材料进行基因序列的测定以及特定功能基因的筛选和分析等。由于指纹图谱技术依赖于 PCR 技术，而在 PCR 扩增过程中会由于引物的问题以及退火的温度等因素使一些序列被人为放大，影响对菌种数量的估计，而宏基因组技术无需 PCR 扩增，可以真实体现所研究材料中微生物菌群的完整遗传信息组成。微生物多样性主要表现为基因组结构的多样性以及某些特异性序列的差异，宏基因组技术通过对口腔样品中微生物菌落指纹及特征性核苷酸序列的快速测定，以系统分析其多样性及其分类地位，发掘丰富的口腔微生物资源[10].
目前宏基因组技术在口腔微生物群落结构变化及其与口腔疾病相关性研究方面应用较多，通过宏基因组技术的分析，研究者发现，人体口腔及唾液中存在着大量未知和未培养的微生物，微生物在口腔中的分布在菌种和菌株水平有显着的个体间差异，但在属的水平上保持一致性[11,12].另外研究者还发现，口腔微生物菌群由于一些“核心微生物组”的存在而使口腔微生物生态环境保持相对稳定[13],但同时不同部位的细菌在种类上具有较高的多样性。宏基因组技术在龋病的发生方面应用较多，相关研究显示，患龋个体的微生物组变异更大，无龋个体的微生物组构成相对保守，但龋病的发生过程中没有检测到特异性的 OTUs（ operational taxonomic units） ,另外，龋齿除了变异链球菌外，还有数十个菌种与之发生密切相关，而且变异链球菌也并非龋病的优势菌群[14].在研究口腔与牙周疾病发生的机制方面，发现了一系列与这些疾病发生相关的细菌，且发现口腔癌症的发生与口腔微生物群落的变化相关联[15],另外，通过对文库基因的筛选，获得了一些与耐药相关的重要基因[16].
由此可见，龋病、牙周炎和牙龈炎等口腔疾病的发生，往往与患者口腔牙菌斑中细菌的变化密切相关，其主要原因是菌斑中微生物群落结构的失调以及微生物多样性的降低所造成的。宏基因组技术的优势在于其能够直接从样品中获得几乎所有相关微生物的基因，再通过测序技术，确认微生物的种类，从而明确病灶中微生物的组成情况。另外，通过宏基因组技术还可以对特定基因进行检测，从而分析相关微生物在口腔中的功能，寻找潜在的致病基因或有益基因，为口腔疾病的早期诊断和治疗以及口腔益生菌的开发提供新的思路。
3 代谢组技术
代谢组学是对一个生物系统中所有的低分子量的代谢物质的全面的、定性的和定量的分析，通过考察生物体系受到刺激或扰动后其代谢产物的变化来研究生物体系的代谢途径的科学。由于代谢（ 物） 是生命活动内在调控的最终结果，直接而全面地反映了生物体的相关信息，所以代谢组学能够体现生命体系功能的变化。代谢组技术主要依赖于相关的检测技术，然后运用信息学平台对相关数据进行分析总结，最终找到代谢产物与机体的生理、病理之间的关系。与传统的以基因型作为微生物分类标准的方法相比，该方法具有快速、高通量和全面的特点，能体现微生物真实的生理过程，特别是为某些表型分类和基因型分类不一致的微生物在鉴定时提供一定的参考[17].由于代谢组学分析的物质组分复杂，性质差异大，还存在各种干扰等问题，很难通过单一的分析手段对它们进行无偏差的全面分析。目前常用代谢组检测技术主要包括核磁共振（ Nuclear mag-netic resonance,NMR） 以及质谱（ Mass spectrometer,MS） 技术。
NMR 技术是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的分析技术，主要包括碳谱（13C NMR） 、磷谱 （31P NMR） 及氢谱 （1H NMR） ,Bourne 等[18]通过磁共振氢谱并进行多元统计分析，结果显示该方法与表型鉴定的相似率达到 92%.另有学者用该方法检测了 3 种牙周致病菌的培养液，发现 3 组数据内部有集中的聚类关系，能够用于对致病菌的快速鉴定。
质谱技术是一种测量离子质荷比（ 质量 - 电荷比） 的分析方法，能够对分子进行鉴定并进行定量分析，常用的质谱技术包括色谱 - 质谱联用技术以及基质辅助激光解析飞行时间质谱仪（ MALDI-TOF）等。有学者[19]采用气相色谱法 - 质谱技术（ CE-MS）分析了氟化物和木糖醇对龋齿菌斑生物膜对碳源利用的影响情况，监测菌斑细菌群落代谢的变化，认为该技术可用于监测饮食和药物对菌斑生物膜中细菌群落的影响，进而对菌斑进行有效控制。另有学者[20]运用飞行质谱技术对细菌群落进行分析，并对群落中生长缓慢或者不易培养的厌氧致病菌进行鉴定，认为该方法是进行细菌群落分析的有效方法。
质谱技术还可用于对细菌的分离鉴定，Hsieh 等[21]将 6 种不同的菌种混合，应用 MALDI-TOF-MS 技术成功地将 6 种不同的菌种区分开。
相关的研究显示，代谢组学技术不但能够对细菌进行鉴定，分析菌群变化规律，还能够跟踪致病菌对特定物质的利用情况，并根据疾病的发生与致病微生物代谢之间的关系，开发抗菌药物。另外通过分析抗菌药物对微生物代谢的影响来预测抗菌药物的作用效果，从而为口腔感染疾病的治疗提供新的思路。但同时代谢组学作为一个新兴的领域，仍然有许多不足之处，首先是代谢产物的提取困难，难以保证提取物的质量和化学性质； 其次是这些产物性质不同，浓度差异大，而不同检测技术对不同物质的灵敏度不同，难以在统一的平台下完成； 最后是目前代谢组数据库很不完善，缺乏统一的标准，制约了该技术的应用。
4 结 语
口腔微生物群是口腔生态系统的重要组成，其动态变化及多样性的差异与口腔健康、口腔疾病甚至全身性疾病的发生关系密切，只有全面认识口腔微生物的菌群组成及改变，才能深度揭示口腔微生物组与口腔及全身健康、疾病的关系。相关生化分析技术以及分子生物学技术的应用，能够突破传统的纯培养技术的限制，对特定部位的微生物群落结构进行全面的分析，既能够检测已知的细菌种类，还能够检测未知的细菌，从而真实反映菌群在口腔中的存在状态，为探索口腔中微生物的作用机制，寻找口腔疾病的发病原因、判断预后以及诊断治疗等提供有益参考，也有利于口腔疾病的防治以及促进人类的健康。
参考文献
[1] Avila M,Ojcius D-M,Yilmaz O. The oral microbiota: Living witha permanent guestm[J]. DNA Cell Biol,2009,28（ 8） : 405-411.
[2] Dewhirst F-E,Chen T,Izard J,et al. The human oral microbiome[J]. J Bacteriol,2010,192（ 19） : 5002-5017.
[3] DOU Hui-juan,GUO Wen-tao,WANG Ting-ting,et al. Progresson the research technology of intestinal flora[J]. Chin J Microecol,2014,26（ 1） : 119-121. （ in Chinese）窦会娟，郭文涛，王婷婷，等。 肠道菌群研究方法进展[J]. 中国微生态学杂志，2014,26（ 1） : 119-121.
