摘 要： 华根霉 (Rhizopus chinensis) 属于根霉的一种, 其产物具有较高的液化能力、酯类合成能力, 广泛存在于土壤, 植物残体和酒曲中。文章介绍了华根霉的基本培养特征, 产脂肪酶及其相关酶基因的诱变和异源表达, 简要介绍了华根霉产淀粉酶、纤溶酶和复合酶的研究进展和蛋白质组学应用在华根霉上的研究进展, 最后简述了华根霉在酿酒、化妆品、生物柴油、医学等方面的应用以及当前华根霉生产过程中存在的问题, 提出了意见和建议, 并对其进一步研究进行展望。
关键词： 华根霉; 研究进展; 应用;
Abstract： Rhizopus chinensis belongs to Rhizopus, and its products has high liquefaction ability and ester synthesis ability. R. chinensis normally existed in soil, plant residues and Jiuqu. The basic culture characteristics of R. chinensis, the mutagenesis and heterologous expression of lipase-producing and the related enzyme genes were introduced. The research progress of amylase, fibrinolytic enzyme and complex enzyme from R. chinensis and the application of proteomics in R. chinensis were briefly introduced. At the same time, the application of R. chinensis in alcoholic drink making, makeup, biodiesel, medical science was discussed. On this basis, the problems existing in the production process of R. chinensis were introduced, some suggestions were put forward, and further research was prospected.
Keyword： Rhizopus chinensis; research progress; application;
1 华根霉简介
华根霉 (Rhizopus chinonsis) 全名中华根霉, 属于接合菌亚门 (Zygomyotina) 、接合菌纲 (Zygomycetes) 、毛霉目 (Mucorales) 、毛霉科 (Mucoaceae) 、根霉属 (Rhizopus) [1]。近年来经过不断地研究, 华根霉的应用市场越来越广泛。
华根霉的生长培养基是土豆琼脂培养基, 接种后24 h内长出白色菌丝, 菌落疏松扩散;48 h后菌丝变成褐色, 假根不发达, 短小, 手指状。华根霉主要靠孢子进行无性繁殖, 形成的孢子囊球形或近似球形, 灰黑褐色至黑色, 能产生球形、椭圆形或短柱形的厚垣孢子[2]。华根霉在15～45℃均可生长, 但是最适生长温度为30℃。华根霉能利用大多数的糖类, 尤其是乳糖和麦芽糖, 但糖的浓度太大反而会影响菌体的生长, 华根霉对有机氮源的利用大于无机氮源[3]。
2 华根霉的研究进展
早在1999年, 徐岩等[4]就改变了传统的产脂肪酶的菌株筛选方法, 以有机相中合成能力为指标, 得到了一株合成己酸乙酯较高的霉菌, 命名为Rhizopus Y-92。2003年刘云秀等[2]通过对不同培养基的筛选, 再进行多次循环平板划线分离和稀释分离, 从甜酒曲中分离出华根霉纯种。随着研究的深入, 对于华根霉的认识也在不断加深, 目前已有大量文献报道了华根霉的生理特性, 华根霉在生长过程中能产生脂肪酶、淀粉酶、纤溶酶等。
2.1 华根霉产脂肪酶
脂肪酶能将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸, 而脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面[5,6], 因此在工业生产中脂肪酶的需求量非常大, 目前脂肪酶的生产渠道之一就是微生物生产。徐岩等[4]在酿酒大曲中分离到一株高产脂肪酶的华根霉菌株, 通过条件优化进一步提高了酶活并将脂肪酶用于酯类物质的合成。颜兴和[7]对华根霉进行钴60诱变和亚硝基胍诱变, 获得诱变菌2113, 其后对其培养基进行了优化, 确定了华根霉2113合成酶活的培养基的最佳营养成分为麦芽糖1%, 蛋白胨4%, 豆饼粉4%, 橄榄油2%, 七水合硫酸镁0.05%, 磷酸氢二钾0.2%, 起始p H 5.5, 又在此基础上对华根霉的接种量、装液量、摇瓶转速进行了正交试验, 得出 (2.2～4.3) ×105CFU/30 m L接种量、30 m L装液量、150 r/min或200 r/min摇瓶转速的培养条件较有利于华根霉2113脂肪酶的生产, 且与出发菌相比, 合成酶活提高了534.01%。WANG D等[8]通过改变发酵罐内的搅拌和曝气来控制发酵液的流型, 从而改善混合和传质, 提高了脂肪酶的产量。此外周艺博等[9]在华根霉液态发酵产脂肪酶的发酵条件方面做了相关方向研究, 确定在装液量为20 m L/250 m L, 摇床转速200 r/min, 初始p H 5.5, 接种量5×107CFU/m L的条件下, 30℃发酵72 h, 脂肪酶合成活性最高, 可达1 080 U/g。
随着技术的进步, 对于华根霉的研究进入了基因时代, 王乐乐等[10]通过3次聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 程序克隆首次得到了华根霉CCTCCM201021脂肪酶全基因序列, 然后将其导入了毕赤酵母 (Pichia pastoris) 中, 最终得出其产的脂肪酶的酶活比野生型华根霉脂肪酶 (Rhizopus chinensis lipase, RCL) 的酶活高约43倍。李飞等[11]研究了基因拷贝数和和甲醇浓度对重组毕赤酵母产脂肪酶的影响, 结果表明基因拷贝数为5的重组菌发酵产酶能力最高, 酶活可达到12 500 U/m L。张谦等[12]又将华根霉脂肪酶基因导入在黑曲霉中进行了重组表达, 最终得出所有重组的菌株都能够进行表达, 其中最高的脂肪酶的活力可达到71 U/m L, ZHANG M等[13]分别将脂肪酶转入大肠埃希菌和毕赤酵母中表达得出毕赤酵母的华根霉r27RCL脂肪酶比在大肠杆菌中产生的华根霉r27RCL脂肪酶活性高1.4倍。随着研究的深入, 赵林水等[14]研究发现, NH4+离子会对重组的毕赤酵母产生一定的影响, YANG M等[15,16]经过研究发现了毕赤酵母在表达的华根霉r27RCLC脂肪酶不会发生糖基化现象但是在毕赤酵母中表达的RCL在14、48、60三个位点会发生N-糖基化。此外, 陈刚等[17,18]进一步研究了华根霉产脂肪酶时最高酶活时的压力与温度:在200 MPa、40℃条件下酶热稳定性最佳, 压力超350 MPa时酶热稳定性显着降低, 继而又研究了盐和压力对RCL的耦合效应, 得出在适当的条件下, 压力和盐可以提高RCL的催化性能和稳定性, 高压对RCL的影响受盐的影响, 同时盐不能防止高压引起的RCL损伤等结论。为了进一步提高酶的活性, 王睿等[19]筛选华根霉r27RCL脂肪酶分子表面的7对二硫键突变位点, 利用PCR技术进行定点突变, 并在毕赤酵母中表达获得突变酶, 最终得出最佳突变酶在60℃的半衰期提高了4.5倍, Tm值提高了4.2℃, 而催化活性保持不变, 蒋蕊等[20]还将华根霉CCTC-CM201021脂肪酶基因的分子改造, 将其氨基酸序列进行了定点突变, 从而使其的亲和性和催化效率更高, p H适应范围也更广。吴厚军[21]也利用定点突变的方法, 通过同源建模和序列比较, 对华根霉脂肪酶基因pro RCL进行定点突变, 构建了突变脂肪酶D190V, 使其最适温度提高了5℃, 65℃半衰期提高了一倍。华根霉产脂肪酶的机理机制作为研究的重点, CHEN G等[22,23,24]研究了压力诱导下根霉脂肪酶盖子运动及催化行为的研究, 得出在200 MPa和40℃条件下, 高压处理脂肪酶的水解能力经历了一个先提高后降低的过程, 在中等压力下, 压力处理降低了反应物与过渡态之间的体积, 继而又继续研究了压力对于酶的构像的影响, 得出当压力分别为200MPa和600MPa时, 酶活性位点与底物的结合亲和力分别为最高和最低的结论。
2.2 对于华根霉的蛋白质组学研究
随着深入的研究, 蛋白质组学也被用于微生物研究领域, 其中双向电泳技术由于灵敏度高, 速度快被广泛应用[25]。目前, 针对丝状真菌的蛋白质组学主要集中在曲霉上, 而郑礼月等[26,27,28]首先将蛋白质组学应用于华根霉, 并创建和优化了华根霉的胞内蛋白质双向电泳技术, 又在此基础上研究了华根霉液态发酵菌体形态差异与其产物有一定的联系, 为研究菌体形态与代谢产生的分子机制提供了技术支持。此后郭月[29]又通过双向电泳技术初步探讨了橄榄油对华根霉合成活性脂肪酶及菌体量的影响机制, 得出橄榄油可以提高脂肪酶的表达量及酶活。蔡军等[30]研究了华根霉固态发酵和液态发酵产胞外蛋白酶的比较蛋白质组学分析, 研究表明固态和液态不同培养方式影响了华根霉产胞外蛋白的组成, 范凯[31]对根霉液态培养生产脂肪酶不同形态菌体的转录组的差异进行了分析, 得出菌体形态的差异显着影响了华根霉的转录组, 从而对其在液态发酵中的产物产生了影响。
2.3 华根霉产其他酶
除了脂肪酶, 华根霉也产淀粉酶, 纤溶酶和复合酶。刘芳等[32,33]从甜酒小曲中分离出华根霉淀粉酶菌株, 并通过紫外诱变得到了菌株酶活力高的优良变株SCLG-华根霉28, 接着又通过单因素和正交试验对其产酶条件进行了优化, 最终将其酶活提高了60.96%。汪彬彬等[34]通过PlackettBurman (PB) 试验和Box-Benhnken Design (BBD) 试验进一步对其发酵培养基进行优化, 确定了华根霉产糖化酶的最佳发酵条件为橄榄油0.01%、酪蛋白胨8.14%、麦麸4.32%, 该条件下酶活比优化前提高81%。刘晓兰等[35]从南方小药酒中分离出的华根霉12#, 对其经过固体发酵得到了多种纤维活性成分, 并经过多种方式对活性组分进行分离提纯, 得到电泳纯的纤溶酶。YIN J等[36]利用中华根霉12#固态发酵生产饲用复合酶, 试验结果表明中华根霉12#固态发酵生产的饲用复合酶可以用于降低饲料中的某些抗营养因子, 改善饲料品质。
3 华根霉的应用
3.1 在酿酒方面
古语有云:“酒香不怕巷子深”, 华根霉产的脂肪酶可以催化酸类物质和酒精合成酯类, 而酯类是酒中重要的增香物质, 对酒类风味的形成至关重要。刘雪等[37]用生物酶法对华根霉合成己酸乙酯的方法进行了研究, 通过优化确定了在工厂中合成己酸乙酯的最佳条件, 得到的己酸乙酯可达2302mg/100m L。利用脂肪酶具有酯类合成能力的特性, 崔如生等[38]制取了一种新的调味酒, 而这种调味酒制成的勾兑酒去除了酒精和香料味, 窖香浓郁, 醇香回甜。
3.2 在合成生物柴油方面
生物柴油是指由动植物油脂与短链醇进行转酯化反应所制备的脂肪酸单酯, 生物柴油是一种替代石油柴油的可再生燃料。目前工业生产生物柴油的主要方法是酯交换法, 而脂肪酶则可通过酯交换反应生产生物柴油[39,40]。贺芹等[41]首次将华根霉CCTCC M201021全细胞菌体作为催化剂转化油脂合成生物柴油, 得出华根霉全细胞脂肪酶在无溶剂体系中脂肪酸甲酯最高收率可达86.0%以上, 在有机溶剂体系中转酯化反应中脂肪酸甲酯的最高收率为86.7%。
3.3 在化妆品方面
脂肪酶不仅可以合成酯类物质, 还可以水解发酵底物中的油脂等。杨敏等[15]用初步筛选得到的含有脂肪酶的华根霉CCTCCM201021全细胞催化油酸与油醇酯化合成油酸油醇酯, 并对其的转换率进行了探索, 研究表明, 华根霉全细胞脂肪酶对油酸油醇酯合成反应具有很强的催化能力, 在优化的反应条件下反应的转化率可达90%以上。王楠等[42]也用华根霉脂肪酶催化生成乙酸香茅酯并得出合成乙酸香茅酯的最佳条件, 最终转化率达到94%。
3.4 在医学方面
血栓栓塞性疾病严重威胁人类生命和健康, 溶栓治疗是血栓性疾病安全有效的治疗手段, 而纤溶酶中血纤维蛋白是溶解血栓的主要成分。迟文鹤[43]利用华根霉TK317固态发酵生产纤溶酶, 随后对编码华根霉纤溶酶的基因进行克隆, 得到编码该纤溶酶的新基因, 并将该基因成功的在大肠杆菌p ET系统中进行了表达。王盛楠[44]构建了华根霉全长cDNA文库, 并从中筛选出一种能编码合成具有水解血纤维蛋白活性基因, 通过其在毕赤酵母中的表达, 对该酶的酶学性质进行了初步的研究, 实验结果表明其所构建的cDNA文库质量较高, 可长期保存并用于新基因的筛选, 且本实验所得的纤溶酶基因是一种新型纤溶酶基因。
4 华根霉研究存在问题及建议
4.1 在生产方面
华根霉的生产主要有固态发酵和液态发酵两种方法。固态发酵法具有工艺简单、发酵条件较为粗放、设备投资及废物产生较少等特点, 但是也存在一些问题, 如占地面积大、产量低、操作技术繁琐、难度大, 质量不稳定等[45]。与固态发酵生产相比, 液态发酵法具有营养源选择范围广、培养条件易于调控、培养周期短、培养过程杂菌污染率低等优点, 但同时液体发酵存在产物杂质较多、发酵后产物提取成本高的问题。针对上述存在问题, 结合华根霉自身特性和产酶条件来看, 华根霉固态发酵的实用性更大, 但是对于华根霉进一步的学术研究, 华根霉液态发酵的应用价值更大。
4.2 在酿酒方面
目前来说虽然华根霉在酿酒方面有着重要的作用, 但是如果只用华根霉做纯种曲酿造出的酒口味较单一, 因此必须要添加其他风味物质才能克服自身的不足, 所以对于华根霉在酿酒中单独作用的研究还很少。因此, 可以着重于将华根霉与其他菌体混合发酵, 取长补短, 将各自的优势发挥出来, 这样既可以提高产品的生产质量, 又可以节约成本, 提高企业的经济效益。
4.3 在现代分子技术方面
虽然将华根霉脂肪酶基因进行突变, 然后转入毕赤酵母中进行表达, 得到的结果是令人满意的, 但是也存在了一些问题, 如很多研究都针对于提高酶活, 但对于应用方面研究的不是很多, 因此可以在分子技术水平上将华根霉研究成果应用于各个领域, 如可以通过分子改造等技术, 通过控制华根霉的菌体形态或者优化条件来大幅提高脂肪酶的酶活和产量, 这样就可以使现代发酵工业达到一个新的高度。
4.4 在蛋白质组学方面
目前的蛋白质组学技术主要研究了华根霉固液态培养方式和华根霉的不同形态与其产物有联系, 但是由于其本身的局限性, 只能提供一个宏观的研究方向, 对于其微观联系以及其内在的机理机制的研究并不清楚, 因此可以在此基础上结合一些其他的技术方法和手段, 如基因组学和转录组学等, 对此进行更进一步的研究。
4.5 展望
随着人们对华根霉研究工作的深入, 华根霉必将在食品、医学、能源等各个领域中发挥越来越大的作用。文章总结了近年来对于华根霉的研究成果, 但目前由于菌种酶活低、生产成本高、技术落后等原因华根霉在国内的应用还比较少, 因此我们将来要做的就是采取各种行之有效的高新技术, 发展能够满足市场需求的新产品。
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