摘 要： 目的探究湿润生肌膏对肛瘘术后患者的临床疗效。方法90例患者随机分为3组, 每组30例, 其中观察组给予湿润生肌膏, 对照组给予龙珠软膏, 凡士林组给予凡士林纱条, 每日换药1次至创面愈合。然后, RT-PCR法检测术后用药第7天各组创面肉芽组织中VEGF、b FGF mRNA表达, 以及创面肉芽组织中毛细血管数, 并观察术后创面愈合时间。结果与对照组、凡士林组比较, 观察组术后第7天创面肉芽组织VEGF、b FGF mRNA表达显着提高 (P<0.05) , 毛细血管数显着增加 (P<0.05) , 创面愈合时间显着减少 (P<0.05) 。结论湿润生肌膏可通过促进创面肉芽组织VEGF、b FGF mRNA表达及促进肉芽组织毛细血管生成, 从而加快创面修复进程, 对肛瘘术后患者有重要的应用价值。
关键词： 湿润生肌膏; 肛瘘; 临床疗效;
Keyword： Shirun Shengji Ointment; anal fistula; clinical effects;
肛门直肠瘘简称肛瘘, 是指直肠或肛管与周围皮肤相通的一类常见疾病, 病因大多为肛周脓肿或直肠肛门损伤。目前其主要治疗方式为手术, 术后创面为防止继发感染需予以暴露直至愈合, 但自然情况下术后创面愈合缓慢, 病程长, 严重影响患者生活质量, 故如何促进术后创面愈合成为临床工作中面临的关键问题。本研究对湿润生肌膏促进肛瘘创面愈合的疗效及相关机制进行探索, 以期为该制剂的临床应用提供依据, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 对象、分组、一般资料、临床诊断标准
研究对象为2014年6月至2016年12月于贵阳中医学院第一附属医院肛肠科收治的90例单纯性肛瘘术后患者, 随机数字表法分为3组, 其中术后使用湿润生肌膏治疗的30例患者作为观察组, 使用龙珠软膏治疗的30例患者作为对照组, 使用凡士林纱条治疗的30例患者作为凡士林组, 3组性别、年龄、体质量、创面平均纵经差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性, 见表1。临床诊断标准参照美国结直肠外科医师协会于2011年推出的美国肛周脓肿和肛瘘治疗指南[1], 即内口在肛隐窝, 仅有1个瘘道通过外括约肌皮下部或浅部, 与皮肤相通;所有创面纵径在2.5~3.0 cm之间、术后伤口深度达外括约肌浅部的低位单纯性肛瘘。患者及家属均自愿同意参与本研究, 并签署知情同意书。
表1 3组患者一般资料比较 (±s, n=30) Tab.1 Comparison of general data among the three groups (±s, n=30)
1.2 材料
Leica RM2235切片机 (德国Leica公司) ;Olympus DSX100光学显微镜 (日本Olympus公司) ;NanoDrop 2000超微量分光光度计 (美国NanoDrop公司) ;Applied Biosystems 9700实时荧光定量PCR仪 (美国Applied Biosystems公司) ;Eppendorf 5424R高速冷冻离心机 (德国Eppendorf公司) 。RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒、SYBR Green核酸荧光染料 (日本TaKaRa公司) ;苏木素-伊红试剂盒 (北京博奥森生物技术有限公司) ;龙珠软膏 (马应龙药业集团股份有限公司) 。甲醛、甲醇、异丙醇、无水乙醇等 (国药集团化学试剂有限公司) 。
2 方法
2.1 湿润生肌膏制备
组方黄芩、黄柏、甘草、白芨、紫草、冰片 (湖北西银和生物科技有限公司, 25 kg/桶, 批号20140409) 、硼砂 (湖北西银和生物科技有限公司, 25 kg/袋, 批号20140328) 、川芎、壁虎粉。将黄芩、黄柏、甘草、白芨、川芎、壁虎粉洗净后, 105℃下干燥4 h, 与紫草一起粉碎, 过120目筛, 加入冰片和硼砂, 研匀, 加入乳膏基质 (硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液状石蜡、白凡士林、羊毛脂作为油相, 三乙醇胺、蒸馏水作为水相, 分别于水浴上加热至80℃左右。等温下将水相缓慢倒入油相中, 水浴上不断搅拌至呈乳白色半固体状, 再在室温下搅拌至近冷凝) , 研匀, 即得。
2.2 创面处理及术后给药
术前均备皮、清洁灌肠, 连续硬膜外麻醉。患者均行瘘切除术, 修剪创缘, 使切口呈下窄上宽的“V”字型, 以便引流通畅, 切口均不缝合, 创面纵径2.5~3.0 cm。换药前均常规消毒, 每天1次至创面愈合 (术后均使用同种抗生素5 d、止血药3 d、止痛药3 d) 。
2.3 标本收集
术后第7天换药时, 组织剪剪下2.0 mm×2.0 mm新鲜肉芽组织, 取30 mg左右置于冻存管中液氮保存, 剩余组织放入事先准备好的10%福尔马林溶液试剂瓶中, 作好编号, 送至病理实验室。
2.4 肉芽组织VEGF、bFGF mRNA表达检测
采用RT-PCR法。液氮中取出30 mg肉芽组织, 无菌条件下剪碎并研磨, 加入1 m L RNAiso Reagent试剂, 冰上裂解5 min后吸取上清液, 加入1.5 m L离心管中, 严格按照说明书进行提取, 将所得RNA沉淀于室温下干燥10 min, 50μL无核酶水稀释沉淀并混匀, 37℃下促溶5 min, 超微量分光光度计检测RNA浓度。取1μg进行逆转录, 严格按照试剂盒说明书进行操作, 得到20μL PCR cDNA产物后, 无核酶水稀释至500μL, RT-qPCR体系配置10μL SYBR Green核酸荧光染料, 加入5μL (10 ng) 模板cDNA及5μL引物, 每个样品设置3个平行孔, 置于PCR仪中进行定量分析。循环参数为预变性94℃4 min;扩增条件为94℃30 s, 60℃1 min, 共40个循环;血管内皮生长因子 (VEGF) 正向引物GGGCGCGCCGCGGAGGGGGT-GCTGG, 反向引物AGACCCTGGTTGCCAGGTCAT-GCGG, 扩增引物249 bp;碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 正向引物GGAGCCCAGGGAATGC-CAAAGCCCT, 反向引物GCAGGTGGAAAGATCT-GATCTTGGA, 扩增引物211 bp。以β-actin为内参基因, 其正向引物序列TGGCACCCAGCAC AATGAA, 反向引物序列CTAAGTCATAGTCCGC-CTAGAAGCA, 目的片段186 bp;以VEGF、b FGF表达量与内参基因表达量的比值作为其mRNA相对表达量。
2.5 肉芽组织毛细血管数检测[2]
采用苏木素-伊红染色。取出10%福尔马林溶液固定好的肉芽组织, 二级水冲洗后自然晾干, 进行石蜡包埋, 于50%、70%、80%、90%、95%乙醇及无水乙醇中各处理40 min, 无水乙醇与二甲苯混合液 (比例1∶1) 处理1 h, 二甲苯处理30 min, 二甲苯与软蜡 (比例1∶1) 处理1 h, 软蜡、硬蜡分别处理1 h, 切片机制成4μm切片, 之后严格按苏木素-伊红试剂盒说明书进行染色。苏木素染色切片在光学显微镜下观察, 每张切片取5个视野, 计算每个视野内具有完整管腔的毛细血管数 (×200) 。
2.6 创面愈合时间测定
即创面完全上皮化所需时间, 上皮化依靠肉眼观察[3]。每天换药观察创面愈合程度, 如创面被新生肉芽组织填满, 覆盖组织完全上皮化, 即确定为创面愈合时间。
2.7 统计学分析
通过SPSS 17.0软件进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 方差分析比较计量资料间的统计学差异, SNK法进行多组资料间的两两比较, χ2检验比较计数资料间的统计学差异, 检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 VEGF、b FGF mRNA表达
观察组术后第7天VEGF mRNA相对表达量为0.763±0.082, 显着高于对照组的0.401±0.043、凡士林组的0.315±0.032 (P<0.05) 。观察组术后第7天bFGF mRNA相对表达量为1.370±0.127, 显着高于对照组的1.049±0.062、凡士林组的0.597±0.084 (P<0.05) 。见图1。
图1 3组VEGF、b FGF mRNA表达比较Fig.1 Comparison of VEGF and b FGF mRNA expres-sions among the three groups
注:与观察组比较, *P<0.05
3.2 毛细血管数
观察组术后第7天创面肉芽组织镜下, 每个视野的毛细血管数为 (30.06±5.25) 个, 显着多于对照组的 (24.80±4.58) 个、凡士林组的 (15.30±3.07) 个 (P<0.05) 。见图2。
3.3 创面愈合时间
观察组创面愈合时间为 (17.03±3.35) d, 显着短于对照组的 (18.87±2.72) d、凡士林组的 (22.13±3.63) d (P<0.05) 。
4 讨论
肛瘘是一种临床常见病, 主要表现为肛周流脓, 伴疼痛、瘙痒或排便不畅, 大多数患者不能自愈, 需要手术治疗, 但由于手术创口所在肛周活动性大、极易污染, 术后创面不可缝合, 自然愈合过程相当缓慢, 导致患者病程较长, 严重影响生活质量。中医认为, 肛瘘术后创面湿热未尽, 毒热内聚, 并由于经络损伤、气血不畅, 致创面失于荣养, 愈合迟缓;现代医学指出, 重组人表皮生长因子可有效促进创面愈合[4,5], 但目前大多应用于烧伤, 对肛瘘术后创面的愈合疗效尚不确切。
目前, 多种中成药能通过促进创面组织上皮细胞表皮生长因子的释放、上皮细胞的增殖、外基质的合成, 进而加速创面愈合[6,7,8]。课题组前期研究[6]发现, 湿润生肌膏较龙珠软膏、凡士林纱条能更有效缓解患者疼痛, 并可加速患者术后创面愈合, 但相关机制及途径尚不完全清楚。创面修复涉及多种细胞因子参与、成纤维细胞增殖、新生血管形成等多个环节[9], 其中VEGF是由2个分子量17~22 kD亚基形成的二聚体, 在代谢旺盛、供血丰富的组织中有着高表达, 是内皮细胞特异的有丝分裂原[10,11], 具有强大的促血管生成作用, 并对血管内皮细胞有特殊的专一性[12], 其表达增加可有效促进毛细血管内皮细胞增殖、新生血管生成[13]、血管内皮细胞迁移和管腔形成, 整合血管内皮细胞功能结构协调同步发展[14];bFGF与VEGF一样, 作为内皮细胞特异的有丝分裂原也具有广泛的促细胞增殖效应[15,16], 可促进细胞分化, 通过调控内皮细胞迁移、纤溶酶原产生来调控机体内血管新生的整个过程[17,18]。研究结果显示, 观察组术后用药第7天创面肉芽组织中VEGF、b FGF mRNA表达均显着高于对照组和凡士林组, 表明湿润生肌膏能有效上调两者表达, 也在分子层面上体现了该制剂优势, 其机制可能与所含黄芩、黄柏等药材对血管内皮细胞的保护作用有关[19,20,21]。然后, 观察了各组术后第7天创面肉芽组织中毛细血管数, 发现观察组显着多于其他2组, 进一步说明VEGF、b FGF存在协同作用, 可共同促进创面肉芽组织新生毛细血管形成, 而湿润生肌膏可促进两者表达上调, 相比龙珠软膏有着更显着的疗效。同时, 观察组创面愈合时间显着短于其他2组, 也印证了湿润生肌膏对肛瘘创面愈合的确切疗效。
图2 3组毛细血管数比较 (×200) Fig.2 Comparison of blood capillary counts among the three groups (×200)
综上所述, 湿润生肌膏可通过上调VEGF、bFGF mRNA表达, 促进肛瘘术后患者肉芽组织中毛细血管生成, 进而加快创面愈合, 提高生活质量, 有利于预后, 是值得临床推广的治疗方式。
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