摘 要： 目的 探讨基因化疗敏感性与化疗结局之间的关系。方法 纳入我院2011年1月1日至2017年12月31日38例, 平均年龄16.32岁, 男18例, 女20例。病变部位:股骨远端25例, 胫骨近端9例, 肱骨远端2例, 髋骨1例, 锁骨远端1例, 均为普通型骨肉瘤。通过实时PCR和DNA测序, 确定患者化疗前样本中化疗相关基因突变和表达程度。检测的基因包括异环磷酰胺相关基因CYP2C9*3, 铂类相关基因ERCC1、BRCA1、XRCC1、GSTP1、MRP2和阿霉素相关基因TOP2A、ABCB1、GSTM1、GSTT1等。对PCR和测序结果进行系统性分析来评估患者对化疗药物的敏感性。患者均行异环磷酰胺+铂类+阿霉素化疗方案, 通过疼痛、肿瘤大小、肿瘤边界及肿瘤内部是否出现钙化灶评估临床化疗效果。结果 个体新辅助化疗结果显示化疗有效率63.2% (24/38) 。基因检测分析显示, 异环磷酰胺敏感率89.5% (34/38) , 铂类敏感率81.6% (31/38) , 阿霉素敏感率57.9% (22/38) ;基因敏感性中, 仅对一种药敏感的患者化疗有效率为0% (0/3) , 对任意两种药敏感的患者有效率为70% (14/20) , 三药敏感者有效率为66.7% (10/15) 。结论 多种化疗药物敏感的患者, 其化疗有效率明显高于仅对一种药敏感的患者。但是对于敏感性较差患者的化疗方案该如何调整, 还有待后续研究。而且需要通过对更大样本结果的分析来提高研究结果的可信度。
关键词： 骨肉瘤; 放化疗, 辅助; 药物疗法; 基因;
Abstract： Objective To explore expressions and mutations of chemosensitivity-related genes, and to discuss the correlation between gene and clinical outcomes. Methods This study selected 38 osteosarcoma patients from 2011 to 2017. The mean age was 16.32 years. There were 18 males and 20 females. Location: 25 patients in the distal femur, 9 patients in the proximal tibia, 2 patients in the distal humerus, 1 patient in the hip and 1 patient in the distal clavicle.All of them were common osteosarcoma. Expressions and mutations of chemosensitivity-related genes were detected via real time PCR and DNA sequencing, including ifosfamide-related gene ( CYP2 C9*3) , platinum-related genes ( ERCC1, BRCA1, XRCC1, GSTP1, MRP2) , and doxorubicin-related genes ( TOP2 A, ABCB1, GSTM1, GSTT1) .Chemosensitivity was evaluated by a systematical analysis of the results of PCR and DNA sequencing. All patients underwent the same chemotherapy regimen including ifosfamide, platinum and doxorubicin. Clinical outcomes were evaluated by pain, tumor size, tumor boundaries and calcification. Results Neoadjuvant chemotherapy effective rate was 63.2% ( 24/38) . Sensitive rate: ifosfamide 89.5% ( 34/38) ; platinum 81.6% ( 31/38) ; doxorubicin 57.9% ( 22/38) . Gene sensitivity: sensitive to one drug, effective rate 0% ( 0/3) ; sensitive to two or three drugs, effective rate 70% ( 14/20) ; sensitive to three drugs, effective rate 66.7% ( 10/15) . Conclusions Patients who are sensitive to multiple drugs have better chemotherapy efficiency than to only one drug. More research is needed on the adjustment of chemotherapy regimen of patients with low sensitivity. Large-scale samples are recommended to enhance the reliability of the conclusion.
Keyword： Osteosarcoma; Chemoradiotherapy, adjuvant; Drug therapy; Gene;
骨肉瘤是儿童和青少年间最常见的恶性原发性骨肿瘤。骨肉瘤大约有80%发生在四肢长骨, 尤其是在股骨远端、肱骨近端和胫骨近端, 20%发生在中轴骨和骨盆。现行的骨肉瘤临床治疗标准建立于20世纪80年代, 主要包括术前化疗、手术和术后化疗;在现今的新辅助化疗中, 一线药物主要包括异环磷酰胺、铂类、阿霉素和甲氨蝶呤[1]。但是在临床应用的过程中发现, 患者易产生化疗耐药性, 导致化疗失败, 其主要表现为复发和远处转移。因此, 如何提高骨肉瘤的化疗效果, 成为骨肉瘤治疗的首要问题[2]。肿瘤的异质性导致不同患者对同种化疗药物的反应不同, 所以提高治疗预后最有效的途径是避免无效化疗。
有研究通过对肺癌、乳腺癌和结肠癌的全基因测序, 确定了大量的基因突变;“细胞致癌作用和肿瘤异质性主要是由于基因信息的改变”这一观点[3], 也得到了学术界的广泛认可。高通量测序可以快速准确地对大量基因进行测序, 通过这项技术可以发现许多与化疗敏感性和细胞毒性相关的基因突变和基因多态性;通过实时定量PCR技术, 可以检测基因表达程度[4]。例如ERCC1基因的高表达会导致铂类耐药[5];CYP2C9的基因多态性会影响异环磷酰胺的敏感性[6]。然而这些基因在临床中的化疗效果与检测结果是否相同, 还有待研究。
资料与方法
一、纳入与排除标准
1. 纳入标准:
(1) 我院2011年1月1日至2017年12月31日收治的患者; (2) 经过病理确诊为骨肉瘤者; (3) 签署知情同意书者。
2. 排除标准:
(1) 病理诊断不明确者; (2) 术前未完成4次新辅助化疗者; (3) 不能遵医嘱定期化疗者; (4) 拒绝化疗者; (5) 拒绝签署知情同意书者。
本研究共纳入38例, 男18例, 女20例, 平均年龄16.32岁。病变部位分布为股骨远端25例, 胫骨近端9例, 肱骨远端2例, 髋骨1例, 锁骨远端1例, 病理学诊断结果均为普通型骨肉瘤。本项研究已通过西京医院伦理委员会认证 (表1) 。
二、样本收集
患者行病理活检同时获得肿瘤软组织作为检测样本。将取得的样本剪切成直径为3～5 mm的碎片, 置于液氮保存。
三、骨肉瘤药敏相关基因的选择
本研究分析所选择的肿瘤基因, 均已通过先前的研究证实与化疗药物的代谢有关。笔者查阅了PubMed、Medline、万方医学、知网医学等文献数据库, 选取了与临床一线化疗药物代谢相关的11个基因进行分析, 包括:异环磷酰胺相关基因CYP2C9*3[7];铂类相关基因ERCC1、BRCA1、XRCC1、GSTP1、MRP2[8], 以及阿霉素相关基因TOP2A、ABCB1、GSTM1、GSTT1等[9]。部分基因参与DNA修复, 如ERCC1、BRCA1、XRCC1;部分基因编码酶蛋白, 参与生化反应, 如GSTP1、GSTM1、GSTT1;其它基因通过参与药物催化或物质转运, 在骨肉瘤化疗中发挥作用。
表1 患者基线、化疗结局及基因敏感性Tab.1 Characteristics, prognosis and efficacy
注:LDF左侧远端股骨, RDF右侧远端股骨, LPT左侧近端胫骨, RPT右侧近端胫骨, LDH左侧远端肱骨, RDH右侧远端肱骨, RDC右侧远端锁骨, LHip左侧髋骨, P进展, S稳定, R缓解Notice:LDF/RDF left/right distal femur;LPT/RPT left/right proximal tibia;LDH/RDH left/right distal humerus;RDC right distal clavicle;LHip left hip;P progression;S stable;R remission
1. 基因检测:
基因mRNA表达水平选用实时定量PCR (Real time PCR) 检测方法, 使用ABI荧光定量试剂盒, 通过ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测;基因突变和基因多态性选用DNA测序、ARMS法, 使用ABI PCR测序试剂盒和ABI荧光定量试剂盒, 通过ABI 3730XL DNA测序仪、ABI 7500荧光定量PCR仪进行检测。
2. 化疗效果评估:
化疗效果临床评估包括:疼痛 (NRS疼痛数字评价量表) 、肿瘤大小、肿瘤边界是否清晰及肿瘤内部是否出现钙化等。评估结果主要分为三级, 即缓解、稳定与进展。缓解:患者疼痛减轻, 肿瘤边界清晰、大小无增加, 肿瘤区域出现钙化或钙化增多;稳定:疼痛减轻或无明显变化, 肿瘤边界叫化疗前无变化、大小无增加;进展:疼痛加重, 肿瘤边界模糊不清、大小增加, 肿瘤区域没有钙化。另外, 肿瘤在化疗过程中出现远处转移时, 也归为进展。缓解和稳定表示化疗有效, 进展则表示化疗无效[10]。
四、统计学处理
数据使用SPSS 18.0软件分析。若总样本量<40或表1～4中有数据期望频数<1, 则使用Fisher精确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、新辅助化疗方案
所有患者均接受异环磷酰胺、铂类+阿霉素循环两周期的化疗方案 (表1) 。叮嘱患者化疗期间若出现白细胞降低等不良反应, 及时就诊, 待症状消失后继续化疗。
二、化疗敏感性检验
根据研究所选取的11个基因突变和基因表达, 笔者制订了评估多种药物敏感性的标准 (包括异环磷酰胺、铂类和阿霉素, 表2) , 其核心是不同基因表达程度和突变情况的综合。检测mRNA表达水平的基因包括ERCC1、BRCA1、TOP2A等, 检测基因突变或基因多态性的基因包括CYP2C9*3、ABCB1、XRCC1、GSTP1、MRP2、GSTT1及GSTM1等。
三、化疗敏感性评估
3例仅对一种药敏感, 20例对两种药敏感, 15例对三种药均敏感 (表1) 。患者对异环磷酰胺、铂类、阿霉素的敏感率分别为89.5% (34/38) 、81.6% (31/38) 、57.9% (22/38) , 而且明显高于阿霉素 (P<0.05) (表3) 。
四、化疗效局
24例化疗有效, 14例化疗无效 (表1) 。
其中基因检测仅对单种药敏感的患者临床化疗有效率为0% (0/3) , 对任意两种药敏感的患者为70% (14/20) , 三药敏感者为66.7% (10/15) (表4) 。
五、个案分析
1. 患者, 男, 19岁, 右侧股骨远端骨肉瘤:患者基因敏感性为三药均敏感, 化疗结局为缓解。
患者化疗前查体发现:右侧大腿下段及膝关节明显肿胀, 可触及大小约12 cm×6 cm×4 cm质硬包块, 边界不清, 活动度差;髌骨上极上方5 cm处肢体周径左/右=33 cm/42 cm。NRS评分3分。2016-05-08行右股骨远端病变穿刺活检, 病理回报骨肉瘤。
经过4次术前化疗后, 患者自感包块减小, NRS评分0分。化疗前与化疗后X线比较发现, 化疗后包块明显缩小, 肿瘤边界变清, 瘤内钙化灶增多 (图1) 。
2. 患者, 女, 9岁, 左股骨远端骨肉瘤:
患者基因敏感性为单药敏感, 化疗结局为进展。患者于2017年7月无明显诱因发现左大腿内侧包块, 局部疼痛, 间断性发作, 有夜间痛, 行左股骨远端病变穿刺活检, 术后病理报普通型骨肉瘤。后给予顺铂+阿霉素、异环磷酰胺交替化疗4次, 化疗后患者感疼痛基本消失, 包块较前增大。比较化疗1个月前后X线片结果可看出, 经过化疗后骨膜反应更加明显, 骨质破坏也更严重;包块较前增大, 肿瘤边界模糊不清, 瘤内钙化灶无变化 (图2) 。
讨论
骨肉瘤是一种有侵略性的恶性原发性骨肿瘤, 好发于青少年;年龄<20岁的骨肿瘤患者中, 有60%是骨肉瘤;未接受化疗的骨肉瘤患者中, 有80%发生了远处转移[1]。因此, 有效的化疗对于骨肉瘤患者的生存率是至关重要的。现有的骨肉瘤化疗方案都是通过各个随机对照试验结果得出的, 并没有完全反映肿瘤的异质性。换言之, 不同的人对不同化疗药物的敏感性是不同的 (表1、2) 。因此对于这种异质性肿瘤来说, 个体化信息的研究和治疗方法是必要的。在本次研究中, 对所有患者施行统一的化疗方案, 通过分析基因化疗敏感性和临床化疗结局之间的关系, 希望通过基因敏感性来指导临床个体化治疗[11]。
图1 例2患者化疗前后X线结果比较a:化疗前;b:化疗后Fig.1 X-ray before and after chemotherapy (No.2) a:Before chemotherapy;b:After chemotherapy
表2 38例骨肉瘤患者化疗敏感性相关基因表达与突变分析Tab.2 Analysis of chemosensitivity-related gene expressions and mutations in 38 osteosarcoma patients
注:“E”代表表达, “Mu”代表突变或基因多态性;“H”代表高表达, “M”代表中度表达, “L”代表低表达;“+”代表该基因型为化疗敏感基因, “-”代表该基因型为化疗耐药基因Notice:E expression, Mu mutation, H high, M medium, L low, “+”sensitive, “-”non-sensitive
基因的敏感性主要取决于基因的表达、突变或基因多态性。
一、异环磷酰胺相关基因
CYP2C9基因具有基因多态性, 除野生型CYP2C9*1以外, CYP2C9基因编码区至少有32种单核苷酸多态性, 编码不同的异型酶。CYP2C9*3就是其中之一。CYP2C9*3反映了氨基酸序列中的一种Ile359-Leu (I359L, A→C) 突变型, 其催化活性与野生型相比较低, 会减慢药物的代谢。由于异环磷酰胺只有在被水解为异磷酰胺氮芥时, 才会发挥抗癌作用。因此, CYP2C9*3突变型细胞会导致异环磷酰胺在体内滞留时间延长, 降低对异环磷酰胺的敏感性[12]。
表3 不同药物的基因敏感性Tab.3 Chemosensitivity of different agents
表4 基因敏感性与化疗有效性的比较Tab.4 Comparison of chemosensitivity and efficacy
图2 例21患者化疗前后X线结果比较a:化疗前;b:化疗后Fig.2 X-ray before and after chemotherapy (No.21) a:before chemotherapy before;b:After chemotherapy
二、铂类相关基因
细胞对抗铂类药物的耐药由多种机制共同作用, 大体包括3个方面: (1) 细胞内有效药物浓度下降, 增加药物泵出, 减少药物摄取和药物失活增加, 都会导致有效浓度降低; (2) 细胞修复DNA损伤能力的提高; (3) DNA损伤介导细胞凋亡信号传导途径异常。
ERCC1和BRCA1基因都是DNA修复基因, 当基因表达上调时, 两种基因会通过不同的方式增强DNA修复能力, 从而拮抗铂类药物的作用[8]。
XRCC1基因可以参与DNA碱基切除修复通路修复DNA, 其外显子6和10 (exon6, exon10) 有单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 。Exon 6易发生突变的非保守位点为Arg194Trp (C→T) , 其中Arg194Arg基因型的化疗敏感性明显低于其它两种基因型, 因此可以推测194Trp基因可能是患者化疗的获益基因;Exon 10易发生突变的非保守位点为Arg399Gln (G→A) , 其中Arg399Arg基因型的化疗敏感性明显高于其它两种, 因此Arg399Arg可能是患者化疗的获益基因[13]。
GSTP1, 谷胱甘肽硫转移酶, 是一类可以通过催化疏水和亲电子的化合物与还原型谷胱甘肽结合, 从而达到解毒作用的酶。其外显子5的多态性表现为第81位点A→G碱基替代, 可导致肽链第105位氨基酸由ATC (异亮氨酸, Ile) 变为GTC (缬氨酸, Val) 。临床随机对照试验显示, Val105Va基因型的铂类化疗药物敏感性明显高于其它两种基因型, 说明这种基因表型可以使铂类药物的外排降低, 在体内积存增加, 从而使患者对铂类化疗敏感性提高[14]。
MRP2, 多耐药相关蛋白2, 是一种跨膜蛋白, 不仅可以代谢内源性物质, 也可以调节细胞内药物、毒物及其代谢产物的浓度, 从而影响药物生物利用度和体内分配。MRP2的SNP有6种, 其中C24T、G1249A、C3972T最常见。临床试验中发现, 仅位于第10外显子的G1249A突变, 会影响铂类化疗的敏感性。发生G1249A突变时, 其表达产物中第417位氨基酸相应地从缬氨酸Val变为异亮氨酸Ile, 使肿瘤患者对铂类化疗药物的敏感性增加。而且, 当MRP2表达增强时, 铂-DNA复合物形成减少, 肿瘤细胞对铂类的耐药增强;另外MRP2也可能通过促进GSH结合的铂离子排出细胞外来增强肿瘤细胞对铂类的耐药性[15]。
三、阿霉素相关基因
TOP2A基因可以编码DNA拓扑异构酶IIα, 这种酶可以在DNA转录的时候控制和改变DNA的拓扑结构。由于蒽环类药物可以与DNA发生联结, 主要通过抑制TOP2A使DNA-TOP2A复合物处于稳定状态, 因此TOP2A是其重要靶酶之一。所以检测TOP2A基因的状态有可能用来评估患者对蒽环类药物的敏感性。TOP2A基因扩增和 (或) mRNA、蛋白的过表达可以使蒽环类药物疗效增加, 反之抑制TOP2A低表达导致蒽环类药物耐药[5]。
ABCB1基因可以编码ATP结合盒亚家族B成员1, 也称为P糖蛋白1 (P-glycoprotein 1, P-gp) , 是细胞膜上把外源性物质泵出细胞的重要蛋白。ABCB1存在单核苷酸多态性, 与阿霉素耐药有关的突变为C3435T (同义突变) 。通过实验证明, CT/TT基因型的肿瘤细胞对阿霉素等化疗药物的敏感性明显优于CC基因型[16]。
GSTM1与GSTT1均是谷胱甘肽硫转移酶的一种, 可以通过于还原型谷胱甘肽结合, 对亲电子物质发挥解毒作用, 包括致癌物质, 治疗药物以及环境毒物等。当基因为非缺失型 (+) 时, 其肿瘤细胞的解毒作用更强, 会降低化疗药物的疗效, 因此肿瘤细胞会产生耐药性[17,18]。
已有相关研究发现了各种基因的表达与骨肉瘤化疗敏感性的关系。张乐宁等[19]通过观察骨肉瘤细胞MG-63在放化疗的作用下, BRCA1表达水平对肿瘤增殖、侵袭、细胞周期和凋亡的影响, 发现放化疗可抑制细胞增殖和BRCA1基因的表达;张晋煜等[20]通过分析骨肉瘤患者的ERCC1基因的单核苷酸多态性, 证明ERCC1第118位氨基酸突变与无病生存率 (SFS) 相关;孙仁光等[21]研究发现, P-gp的表达同阿霉素耐药, GSTP表达同阿霉素、顺铂、丝裂霉素耐药性呈显着正相关, 且GSTP高表达与骨与软组织肉瘤耐药有直接关系, 且影响预后。
通过mRNA表达的分析和基因检测, 38例骨肉瘤患者中异环磷酰胺的基因敏感率最高, 阿霉素最低 (表3) 。临床化疗结果显示, 对多种药物敏感 (两种或三种) 的患者化疗有效率明显高于仅对单种药物敏感的患者 (P=0.043) 。基于患者基因化疗敏感性和临床化疗结局的分析, 可以假设由于大多数患者的基因化疗敏感性不高, 使得只有少部分患者得到了有效的化疗, 从而降低了骨肉瘤患者的化疗有效率。术前的无效化疗不仅不能控制病情, 反而使病程继续进展, 导致肿瘤的远处转移甚至死亡。
总之, 笔者通过检测mRNA的表达程度和基因突变或多态性, 判断患者对化疗药物的敏感程度, 与患者临床化疗结局作对比, 认为基因对多种化疗药物敏感的患者, 其临床化疗效果要优于单个药物敏感的患者。但是对于敏感性较差患者的化疗方案该如何调整, 还有待后续研究。而且此次研究样本量较少, 可信度较低, 需要更大样本的研究来提高可信度。
参考文献
[1]牛晓辉, 徐海荣.骨肉瘤的化疗进展[J].中国癌症杂志, 2012, (9) :663-668.
[2]Tanaka T, Yui Y, Naka N, et al.Dynamic analysis of lung metastasis by mouse osteosarcoma LM8:VEGF is a candidate for anti-metastasis therapy[J].Clin Exp Metastasis, 2013, 30 (4) :369-379.
[3]Weir BA, Woo MS, Getz G, et al.Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma[J].Nature, 2007, 450 (7171) :893-898.
[4]肖鑫, 王臻, 许聘, 等.基于高通量测序技术的骨肉瘤基因研究与个体化治疗[J].中华骨科杂志, 2014, 34 (4) :466-471.
[5]潘伟康, 余辉, 王怀杰, 等.肾母细胞瘤中ERCC1、TUBB3、TOP2A mRNA的表达及临床意义[J].西安交通大学学报 (医学版) , 2016, 37 (5) :689-692.
[6]王亮, 钟武.CYP2C9*3和VKORC1基因多态性对华法林预防骨科术后下肢深静脉血栓效果的影响[J].上海交通大学学报 (医学版) , 2013, 33 (10) :1360-1363.
[7]宿利清, 付秀华, 郭利萍.耐药基因与肺癌药敏的相关性研究[J].内蒙古医学杂志, 2014, 46 (5) :518-521.
[8]孙俊.铂类抗肿瘤药物及其临床研究进展[J].中国药业, 2008, 17 (23) :1-3.
[9]翟宝进, 伍烽, 邵泽勇, 等.阿霉素诱导人肝癌细胞多药耐药株的建立及其生物学特性评价[J].癌症, 2004, 23 (4) :391-395.
[10]Xiao X, Wang Z, Zhang H, et al.Individualized chemotherapy for osteosarcoma and identification of gene mutations in osteosarcoma[J].Tumour Biol, 2015, 36 (4) :2427-2435.
[11]Chen Y, Yang Y, Yuan Z, et al.Predicting chemosensitivity in osteosarcoma prior to chemotherapy:An investigatonal study of biomarkers with immunohistochemistry[J].Oncol Lett, 2012, 3 (5) :1011-1016.
[12]吴逢波, 陈泽莲, 徐, 等.CYP2C9基因多态性与合理用药研究[J].中国药房, 2007, 18 (29) :2308-2309.
[13]任翊, 汪得胜, 李卓, 等.汉民族XRCC1基因399位密码子单核苷酸多态性与原发肝癌关系的研究[J].临床肝胆病杂志, 2008, 24 (5) :361-364.
[14]刘新兰, 赵艳姣, 黄英, 等.乳腺癌分子分型与GSTM1、GSTT1和GSTP1 (rs1695) 基因多态性的关系及意义[J].宁夏医学杂志, 2014, 36 (4) :301-304.
[15]余君, 黄邵鑫, 汪春红.MRP1/MRP2与重金属转运的研究进展[J].毒理学杂志, 2013, (1) :57-60.
[16]丁征, 邓婕, 宋洪涛.MDR1基因多态性对相关药物药动学影响研究进展[J].中国临床药理学与治疗学, 2011, 16 (10) :1191-1196.
[17]全忠, 王帅, 刘毅.谷胱甘肽S转移酶基因多态性与中国人群骨肉瘤化疗敏感性的meta分析[J].海南医学, 2015, 26 (21) :3229-3233.
[18]李启英, 童永红, 黄露迷, 等.GSTM1和GSTP1基因多态性对接受铂类药物化疗的肺癌患者疗效的影响[J].重庆医学, 2014, (20) :2592-2594.
[19]张乐宁.BRCA1蛋白表达在骨肉瘤细胞MG-63放化疗疗效评估中的作用及其机制研究[D].吉林大学, 2017.
[20]张晋煜, 彭灼辉.ERCC基因多态性与骨肉瘤的生存相关性[J].昆明医科大学学报, 2017, 38 (9) :59-65.
[21]孙仁光, 刘泽淼.多药耐药基因1和谷胱苷肽-S-转移酶-π在骨软组织肉瘤患者表达及其与化疗耐药关系[J].中国老年学杂志, 2015, 35 (20) :5823-5825.
