近年来，随着养殖业的快速发展，抗生素被广泛用作畜禽饲料添加剂，用于预防和治疗畜禽疾病，促进畜禽生长。由于抗生素被盲目地过量使用，对环境造成了大量的污染。研究表明，动物体内的抗生素以母体或代谢物的形式随尿或粪便排出体外的量，约占用药量的40%～90%［1－3］。以畜禽粪便为主要肥料的有机肥因含有丰富的有机质及氮、磷元素广泛用于农业生产。对农田土壤、地表和地下水及生态系统中各类生物产生危害，并诱发和传播各类抗生素耐药细菌，威胁着人类的健康与生存环境［4－8］。
分属于青霉素类的青霉素G和普鲁卡因青霉素，分属于磺胺类的磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑，以及分属于四环素类的土霉素、四环素、金霉素和强力霉素是养殖业常用的抗生素类药物［9，10］。研究多关注的是这些药物在地表水或地下水体系，水产品及动物组织中的残留［11－13］，但对有机肥料中青霉素类、磺胺类和四环素类药物的残留研究却未见报道。因此建立同时测定有机肥料中3类抗生素的方法亟待解决，对我国主要商品有机肥及有机肥原料鸡粪、猪粪、污泥等中抗生素类污染的种类和含量筛查和检测起到一定的积极作用。
目前，抗生素残留检测主要的方法有:微生物抑制法、酶联免疫方法、液相色谱法、液相色谱与质谱联用法［14－22］。微生物抑制法和酶联免疫方法属于筛选方法，操作简便、快速，成本低，但是微生物抑制法检测时间较长，易受到其他抗生素的干扰，常缺乏专一性和精确度，酶联免疫方法存在一定的假阳性，需要其他方法进行确认［12］。液相色谱法是较常用的方法，具有分离效果好，测定精度高的优点，但前处理比较复杂。随着质谱技术的发展，液相色谱－质谱联用法正越来越广泛地应用于抗生素残留的分析中，其分析范围广，背景干扰少，灵敏度高，结果精确可靠，将是抗生素残留检测的首选方法。因此本研究采用高效液相色谱－串联质谱法(HPLC－MS/MS)同时测定了有机肥料中青霉素G、普鲁卡因青霉素，磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑，土霉素、四环素、金霉素和强力霉素。到目前为止，国内尚未见高效液相色谱－串联质谱联用同时测定以上抗生素残留的报道。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
仪器:Agilent1200高效液相色谱－API2000三重四极杆串联质谱联用仪，配备电喷雾(ESI)离子源;Biofugestratos离心机;Votex2涡旋仪;固相萃取装置;StrataSDB－L固相萃取小柱。TTL－DCII型氮吹仪，KQ－300DE型超声仪，THZ－D型振荡仪。
试剂:甲酸、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯，购自美国Fisher公司;柠檬酸、磷酸氢二钠等其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;试验用水均为超纯水;Na2EDTA－McIlvaine缓冲液(0.1mol/L，pH=4.0)。
选择3种较常用的磺胺类药物:磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑;选用4种四环素类抗生素:土霉素、四环素、金霉素、强力霉素;青霉素类抗生素:选用青霉素G和普鲁卡因青霉素。上述药物均购自Dr.EhrenstorferGmbH公司，纯度均不低于96.0%。
1.2标准溶液和缓冲液的配制
标准溶液:分别精确称取各种标准抗生素10mg(精确到0.0001g)于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，即得到浓度为1000mg/L的标准贮备液，4℃冰箱内保存。标准工作溶液用超纯水稀释贮备液，现配现用。
Na2EDTA－McIlvaine缓冲液(0.1mol/L，pH=4.0):将21.01g柠檬酸，44.78gNa2HPO4·12H2O和60.5gNa2EDTA·2H2O溶于1.625L水中。
1.3实验方法
1.3.1样品提取与净化
将有机肥料样品混匀，称取1.0g样品于50mL离心管中，加入2×15mL(2次提取，每次15mL)pH=4.0的Na2EDTA－McIlvaine缓冲溶液，涡旋混匀，超声10min后再振荡提取10min，10000r/min高速离心10min，上清水层直接转入活化好的StrataSDB－L固相萃取小柱(500mg/6mL，预先用5mL甲醇、5mL水和5mL缓冲液平衡)。同时收集所有流出液，用20mL乙酸乙酯振荡提取10min后转移提取液于100mL离心管中。固相萃取小柱抽干后用10mL甲醇、5mL乙腈和5mL乙酸乙酯洗脱，合并所有洗脱液于前述100mL离心管中，4500r/min离心5min后将上清液转入鸡心瓶，浓缩近干后用氮气于50℃吹干，用乙腈/0.1%的甲酸水溶液(体积比50/50)定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，待测。
1.3.2检测条件
色谱条件:AgilentXDBC18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm);流动相A为0.1%甲酸水溶液;流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0～4.0min，70%～10%A;4.0～9.0min，10%A;9.0～9.1min，10%～70%A;9.1～13.0min，70%A;柱平衡时间8min。流速0.3mL/min;柱温:室温;进样量:10μL。
质谱条件:多反应离子监测(MＲM)扫描;离子源温度TEM:450.00℃;电喷雾电压IS:+5500V;－4500V;气帘气CUR:25.00psi;雾化气GS1:45.00psi;干燥气GS2:65.00psi;碰撞气CAD:7.00psi(所用气体均为氮气，纯度99.999%);扫描方式:0～9.2min为正离子扫描，9.2～13min为负离子扫描。其他质谱参数见表1。
2结果与分析
2.1提取液的选择
在选择提取液时，首先考虑竞争性螯合剂作为提取溶液，因此本文选取了Na2EDTA－McIlvaine缓冲溶液作为样品提取液，由于酸性溶液比较适合样品中抗生素的提取，但是当pH＜2时，四环素类抗生素容易分解，因此本实验选择了pH=4的Na2EDTA－McIlvaine缓冲溶液作为样品中抗生素的提取液，实验结果证明Na2EDTA－McIlvaine对于9种抗生素的萃取效果同样很好。
2.2净化条件的选择
有机肥料成分复杂，天然有机质(主要为腐植酸)含量较高，对检测的影响很大。因而净化提取液十分必要，本实验采用固相萃取净化技术对样品提取液进行净化。StrataSDB－L固相萃取填料的主要成分是聚苯乙烯－二乙烯基苯聚合物，适合于大多数有机化合物提取，pH范围更宽，无二级副反应存在，与传统的C18反相萃取柱相比，除杂质效果更好，操作性能更为稳定。本实验比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为洗脱液，结果表明，10mL甲醇、5mL乙腈和5mL乙酸乙酯依次洗脱，净化效果较好，回收率高。
2.3流动相的选择
一般来说，通常选用乙腈和甲醇作为流动相中的有机相。由于本实验采用电喷雾模式，去溶剂化十分重要，因乙腈比甲醇更容易气化，所以选择乙腈为流动相中的有机相。大部分抗生素类药物在水溶液中以离子状态的形式存在，提高离子化效率，可以增强待测物在反相色谱柱上的保留，提高其分离度及改善其峰形，通常在流动相中加入酸性物质(如甲酸、乙酸等)或缓冲盐(如甲酸铵、醋酸铵等)，因此本实验选用了含有0.1%甲酸的水溶液做流动相中的水相。
2.4质谱条件的选择
对于串联质谱，一个母离子和两个特征子离子即可满足质谱确证的需要。在本实验中，除青霉素G在电喷雾负离子检测模式下进行一级质谱扫描(Q1扫描)，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、普鲁卡因青霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑均在正离子检测模式下进行一级质谱扫描，分别确定其分子、离子，然后分别对其分子、离子进行二级扫描(子离子扫描)，选择最佳子离子，选取丰度较高的两个离子作为定性和定量离子，然后对离子源温度、电喷雾电压、气帘气、雾化气、干燥气、碰撞气等质谱参数进行优化。本方法所得到的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、普鲁卡因青霉素、青霉素G、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑的离子流色谱图如图1。
2.5线性范围和方法检出限
用空白基质溶液制备浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0mg/L的各抗生素混合基质标准溶液，按上述离子扫描方法进样测定，以浓度为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标分别绘制各抗生素的标准曲线，得到抗生素的线性方程、相关系数和检出限，结果见表2。表2表明，以上抗生素药物在0.05～5.0mg/L浓度范围内呈现良好线性，相关系数均大于0.99。且上述条件下四环素类药物的方法检出限均可达到0.05mg/kg，磺胺类和青霉素类药物的方法检出限可达0.02mg/kg。
2.6准确度和精密度试验
选取样品加标，加标水平分别为0.1、0.5、1.0mg/kg，每个样品重复测定5次，考察本方法的准确度和精密度。结果见表3。有机肥料中抗生素的平均回收率在63.1%～93.4%之间，相对标准偏差为1.7%～9.5%。回收率和精密度等均满足分析要求。
2.7实际样品分析
应用本方法对20个样品进行了测定，样品为猪粪、鸡粪、牛粪等畜禽粪便，采自各城区肥料销售点、肥料生产厂。结果重复性良好，部分四环素类和磺胺类抗生素有检出，土霉素含量为0.052～0.383mg/kg，四环素含量为0.061～0.164mg/kg，磺胺二甲嘧啶含量为0.027～0.149mg/kg。
3结论
本文建立了同时测定有机肥料中3类9种抗生素残留的高效液相色谱－串联质谱法，并对样品的分析条件进行了优化。结果表明，该方法具有灵敏度高、选择性强、快速等优点，可用于有机肥料中9种抗生素残留的同时检测，为检测有机肥料中抗生素残留提供了技术支持。
