丁酸氯维地平的化学名为 4-（2,3-二氯苯基）-1-4-二氢-2-6-二甲基-3,5-吡啶二羧酸甲基-（1-氧代丁氧基）甲酯，是由英国 AstraZeneca 公司研制开发的第 3 代新型短效二氢吡啶类静脉注射用钙通道拮抗剂，于 2008 年 8 月经美国 FDA 批准上市，主要用于急性高血压的治疗及术后血压的控制[1].目前各国药典均未收录丁酸氯维地平的质量标准，其中关于丁酸氯维地平中有关物质测定方法的报道中，熊野娟等[2]采用有缓冲盐的流动相体系，使用梯度洗脱，测定了丁酸氯维地平和 7 种杂质；袁慧雅等[3]仅对丁酸氯维地平进行了研究，并未对专属性试验中产生的降解杂质进一步研究；刘艳华等[4]采用有缓冲盐的流动相体系，并使用梯度洗脱法测定丁酸氯维地平和 10 种杂质。本实验选用丁酸氯维地平及其 14 种杂质来优化色谱方法，有 5 种杂质（杂质II、IV、VII、XIII、XVI）尚未见文献报道，其中杂质 IV 是丁酸氯维地平水解脱去丁酸酯形成的杂质，对丁酸氯维地平原料药的质量具有重要影响，杂质 II、XIII、XVI 是工艺杂质，杂质 VII 是丁酸氯维地平脱氢氧化和水解形成的杂质。经过色谱条件的优化，本实验采用甲醇–环己烷–水（70∶0.5∶30）作为流动相，并根据样品检测及强制降解试验结果，在进行方法学验证过程中，研究了杂质I、III、IV、V.结果表明，此方法专属性高，操作简单、分离度好，重复性好，准确度、精密度高。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1260 型高效液相色谱仪，包括 G1311B二元泵、G1329 B 自动进样器、G1316C 柱温箱和G4212B DAD 检测器。
1.2 药品和试剂
丁酸氯维地平对照品（批号 130306,质量分数99.85%）、原料药（批号 130715、130816、130817、130818）以及 14 个杂质对照品均由天津药物研究院化学制药部提供。甲醇为色谱纯（天津市康科德科技发展有限公司），环己烷为分析纯（天津市凯信化学工业有限公司），水为 Milli-Q 超纯水。
杂质对照品分别为 4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸二丁酰氧甲基酯（杂质I）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸-3-乙氧基-5-甲酯（杂质 II）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸二甲酯（杂质 III）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸-3-甲酯（杂质 IV）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸-3-丁酰氧基甲基酯-5-甲酯（杂质 V）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3-羧酸甲酯（杂质 VI）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-3,5-二羧酸-3-甲酯（杂质 VII）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-3-吡啶羧酸甲酯（杂质VIII）、6-（2,3-二氯苯基）-4-甲基-2-氧代环己基-3 烯-甲酸甲酯（杂质 IX）、二氰基乙基-4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸酯（杂质XI）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸单甲酯（杂质 XII）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸-3-氰基乙氧基-5-乙酯（杂质 XIII）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸-3-丁酰氧基甲基酯-5-乙酯（杂质 XV）、4-（2,3-二氯苯基）-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸-3-氰基乙氧基酯-5-甲酯（杂质 XVI），峰面积归一化法测定质量分数分别为98.23%、96.29%、98.12%、98.46%、98.18%、95.13%、97.58%、95.39%、95.79%、95.54%、96.49%、97.51%、95.15%、96.30%.
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Welchrom C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5?m）；流动相为甲醇–环己烷–水（70∶0.5∶30）；体积流量为 1 mL/min;柱温为 30 ℃；检测波长为240 nm;进样体积为 20 μL.
2.2 专属性试验
2.2.1 样品+1%杂质的溶液 称取丁酸氯维地平及各杂质适量，用甲醇溶解并稀释制成混合溶液。其中丁酸氯维地平质量浓度为 0.3 mg/mL,各杂质质量浓度为 0.003 mg/mL,色谱图见图 1.
2.2.2 强制降解试验 （1）未降解试验 称取丁酸氯维地平适量，用甲醇溶解，制成质量浓度为 1.5mg/mL 的储备液。量取 2 mL 样品储备液于 10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度；（2）酸降解试验 量取样品储备液 2 mL 于 10 mL 量瓶中，在室温下，加入 0.5 mol/L 盐酸溶液 0.5 mL,立即用 20%氢氧化钠调 pH 值至中性，并用甲醇稀释至刻度，同法做空白溶液；（3）碱降解试验 量取样品储备液 2mL 于 10 mL 量瓶中，在室温下，加入 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液 2 滴，立即用 20%盐酸调 pH 值至中性，并用甲醇稀释至刻度，同法做空白溶液；（4）氧化降解试验 量取样品储备液10 mL于50 mL圆底烧瓶中，加 30%过氧化氢 0.5 mL,水浴 90 ℃下加热5 min,放置至室温，再定量转移至 50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，同法做空白溶液；（5）加热降解试验 量取样品储备液10 mL于50 mL圆底烧瓶中，加热回流 4.5 h,再放置至室温，定量转移至 50mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，同法做空白溶液；（6）光照降解试验 量取样品储备液 2 mL 于 10 mL透明量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于光照试验箱（4 500±500）lx 中放置 16 d,同法做空白溶液。
从降解前后的物料平衡和色谱峰质量分数两个方面考察降解试验结果，见表 1、2,图谱见图 2.结果表明：降解前后物料平衡结果在 90%~110%,符合要求。在酸、碱条件下本品易水解为杂质 IV;在长时间光照情况下，易氧化为杂质 V,部分杂质V 经水解可转化为杂质 VII;故本品在保存及运输过程中应避免与水和酸碱接触，避光，密封保存。
分别称取丁酸氯维地平对照品以及杂质 I、III、IV、V 对照品约 15 mg,置不同 25 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度；然后各取 0.5 mL 置同一100 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得 1%储备液（混合）；分别量取 1%储备液（混合）0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL 于不同 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度。再量取杂质V溶液0.5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得 1%储备液；分别量取 1%储备液 0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0 mL于不同 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度。上述溶液即为相应质量浓度的丁酸氯维地平以及杂质 I、III、IV、V 溶液，取相应质量浓度的溶液 20 μL 进样，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表 3.
2.4 检测限
称取丁酸氯维地平对照品、各杂质适量，用甲醇溶解并逐步稀释至信噪比≥3（S/N≥3）相对应的质量浓度，作为检测限，结果见表 4.
2.5 定量限
分别称取丁酸氯维地平对照品以及杂质 I、III、IV、V 约 15 mg,置不同 50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。将上述溶液分别逐步稀释至信噪比≥10 相对应的质量浓度。每份样品进样 20 μL,连续进样 6 次，测定峰面积值，结果其 RSD 值分别为 1.89%、1.94%、1.56%、1.57%、1.38%.
2.6 回收率试验
分别精密称取杂质 I、III、IV、V 对照品 15.08、15.10、15.08、15.14 mg,置不同 50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。分别取各杂质对照品溶液0.5 mL 于同一 50 mL 量瓶中，即得 1%杂质储备液；取 1%杂质储备液 1 mL 于 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得 0.1%杂质对照溶液；称取丁酸氯维地平原料药（批号 130715）约 3 mg,于 10 mL 量瓶，用甲醇溶解并稀释刻度，平行配制 9 份。分别加入 1%杂质储备液 0.8、1、1.2 mL,各 3 份。分别取上述供试品溶液进样测定，记录色谱图。结果表明，杂质 I、III、IV、V 的平均回收率分别为 101.62%、97.54%、110.24%、102.16%,RSD 值分别为 3.28%、1.68%、6.20%、6.41%（n=9）。杂质 IV 回收率较高是由于丁酸氯维地平溶液不稳定，在放置过程中主成分易水解为杂质 IV.
2.7 精密度试验
称取丁酸氯维地平（批号 130715）3 mg 于 10mL 量瓶，按 0.1%的杂质限度（杂质质量浓度为 0.3μg/mL）加入杂质 I、III、IV、V,用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合溶液；将该混合溶液平行进样 6 次，进样 20 μL,记录色谱图，计算各杂质峰面积的 RSD 值，结果杂质 I、III、IV、V 峰面积的 RSD 值分别为 4.45%、0.004%、12.56%、0.003%.
在不同时间由不同操作人员，按上述重复性试验，同法配制混合溶液并进样，记录色谱图，计算各杂质峰面积的 RSD 值，结果杂质 I、III、IV、V的峰面积的日间 RSD 值分别为 4.08%、0.003%、10.17%、9.12%.
2.8 耐用性试验
通过考察不同批次色谱柱、检测波长、柱温的微小变化对混合溶液（混合溶液使用 2.2.2 强制降解试验项下"样品+1%杂质的溶液"）中各峰分离度的影响，并同时测定样品（批号 130715）+0.1%杂质的供试品溶液（该供试品溶液配制方法见 2.7精密度项下混合溶液的配制方法。）研究后表明，杂质 V 与丁酸氯维地平之间分离度不小于 1.5,各峰之间分离度符合要求，并且在各微小变化情况下，杂质总量都在 0.5%左右，杂质总量的 RSD 值为2.90%,杂质个数没有发生变化。
2.9 系统适用性试验
通过耐用性试验结果可知，当杂质 V 与主峰的分离度较好时，其余杂质之间及杂质与主峰之间的分离度符合要求。故系统适用性试验主要考察杂质V 与丁酸氯维地平之间的分离度。取杂质 V 和丁酸氯维地平适量，用甲醇溶解并稀释，制成含杂质 V0.009 mg/mL、丁酸氯维地平 0.3 mg/mL 的溶液，进样测定，记录色谱图，结果杂质 V 与主峰分离度不小于 1.5.
2.10 稳定性试验
称取丁酸氯维地平样品（批号 130715）适量，用甲醇溶解，制备 0.3 mg/mL 溶液，分别于 0、2、4、7、10、12、24 h 进样测定。结果表明，氯维地平、杂质 IV、杂质 III 质量分数的 RSD 值分别为0.12%、97.15%、4.75%.杂质 IV 在 2 h 有所增加，表明样品溶液不稳定，容易水解成杂质 IV,故样品应现配现用。
2.11 样品测定
取 4 批丁酸氯维地平原料药样品，精密称定，加甲醇适量，振摇使溶解，制成 0.3 mg/mL 丁酸氯维地平溶液，作为供试品溶液（供试品溶液需现配现用）；精密量取供试品溶液 1 mL,置 100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照溶液；进样测定，用主成分 1%自身对照法计算质量分数，结果见表 5.
3 讨论
3.1 流动相中水相的考察
分别考察了不同 pH 值情况下测定混合样品，结果显示 pH 值对分离度和峰形影响较小；另外考察了在缓冲盐和纯水的条件下测定混合样品，结果显示不加缓冲盐情况下分离度和峰形均较好，故选择纯水作为流动相中的水相。
3.2 柱温的考察
分别考察了不同柱温（30、35、40 ℃）条件下测定混合样品，结果显示随着柱温的升高，杂质 I峰形变差，杂质 II、V 与主峰之间分离度变小，且柱温高影响色谱柱使用寿命，故选择柱温为 30 ℃。
3.3 色谱柱的考察
分别考察了不同厂家色谱柱（Thermo ScientificC18、AgelaVenusil XBP C18、Cosmosil C18、WelchromC18）测定混合样品，结果显示 Welchrom C18柱测定时杂质与杂质之间及杂质与主峰之间分离度及峰形均较好。
综上所述，在已有对丁酸氯维地平原料药的方法学研究中，文献中采用的方法有的采用了缓冲盐体系作为流动相，使用梯度洗脱，对色谱柱损耗较大，操作繁琐；有的对重要杂质研究不完善。本文在文献的基础上，重新摸索了新方法，采用等度洗脱，不采用缓冲盐体系作为流动相，并使用 14 种丁酸氯维地平杂质对方法进行验证，特别是对杂质 IV的研究，填补了之前文献报道的空白。在方法学验证过程中，稳定性试验、强制降解试验和回收率试验均表明，丁酸氯维地平溶液在放置过程中，易水解为杂质 IV;在强制降解试验中，在长期光照试验情况下，主成分易氧化后转化成杂质 VII;所以对丁酸氯维地平原料药的控制有重要的意义。验证结果表明，此方法专属性高，操作简单，重现性好，准确度高，精密度高，适用于丁酸氯维地平原料药中有关物质检查。
参考文献：
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[3] 袁慧雅， 邓娅琳， 于 鑫， 等。 丁酸氯维地平及其有关物质的测定和处方前研究 [J]. 沈阳药科大学学报，2014, 31（5）： 369-374.
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