人参为五加科植物人参 Panax ginseng C. A.Mey. 的干燥根,红参是人参经过高温炮制后得到的加工品。人参具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力及护心保肝等药理作用。乙醇在体内主要经肝脏代谢,其代谢物乙醛及代谢过程中产生的活性氧会对肝脏造成损害,长期饮酒和过量饮酒,会造成乙醇在体内堆积,对肝脏造成不同程度的损伤,损伤程度从轻到重表现为脂肪肝、肝纤维、肝硬化[1],引起机体内天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、三酰甘油(TG)、丙二醛(MDA)等生化指标水平增高。人参皂苷是红参的主要活性成分,《中国药典》和国家标准均以人参皂苷为红参的考核指标。近年来,有研究发现红参具有保肝功能[2-3],本文旨在研究人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤的防治作用,揭示作用机制,为红参的临床应用提供依据。
1 材料与与仪器
1.1 仪器
Infinite M200pro 酶标仪(瑞士帝肯);Lecia-DM2500 微生物显微镜,德国 Lecia 公司。
1.2 药物与试剂
鲜人参,为 5 年生,产自吉林省抚松县,由长春中医药大学王淑敏教授鉴定为五加科人参属人参Panax ginseng C. A. Meyer 干燥根;联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司,批号 A02130407);56°北京红星二锅头酒(北京红星二锅头酒厂,批号20140224);ALT 试剂盒、AST 试剂盒、MDA 试剂盒、GSH 试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20150112);TG 试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司,批号 2015040104)。
1.3 实验动物
清洁级 ICR 雄性小鼠,体质量 20~22 g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK-(吉)2014-005.
2 实验方法
2.1 红参炮制
称取鲜人参约 300 g,用纱布包好,放入蒸参箱,在 60 min 升温到 100 ℃后蒸制 6 h,蒸制完毕后置于 50 ℃烘干箱内烘干。将烘干后的红参研碎成粉,过 80 目筛。
2.2 人参皂苷提取物(Ginseng saponin extracts,GE)制备
称取红参粉末,加入 8 倍量 80%乙醇,超声提取(500 W,100 Hz)30 min,抽滤,滤渣加入 6倍量乙醇超声 30 min,滤过,合并滤液,40 ℃水浴蒸干,加入适量水溶解,即得人参皂苷提取物(人参总皂苷含量为 3.84%),4 ℃下保存待用。
2.3 动物分组
取清洁级 ICR 雄性小鼠 72 只,正常喂养 5 d后,将其按体重平均分为 6 组,分别为对照组、阳性组(联苯双酯)、模型组及 GE 高、中、低剂量组,每组 12 只。
2.4 动物造模及给药
给药剂量按照成人日均用药量与小鼠给药量进行剂量换算,除对照组每天 ig 等体积的蒸馏水外,其余各组 ig 给予 56°白酒,给药剂量为 0.2 mL/20g,1 次/d,造模 5 d.给药组给予 GE,低、中、高剂量组每日分别给予 0.38、0.75、1.13 g/kg 生药材浓度的 GE,阳性对照组给予联苯双酯 0.90 mg/kg,给药后 1 h 给予 56°白酒,1 次/d,连续 30 d.小鼠给药期间每周进行称质量并记录,并观察小鼠的毛色、饮食、行为及死亡情况。
2.5 样本采集
处理前禁食 12 h,给药及白酒 1 h 后,小鼠摘眼球取血,常温静置后待其凝固,3 000 r/min 离心15 min,取血清,?80 ℃保存待测。采血后,迅速剖取肝脏,用冷生理盐水洗净,滤纸吸湿后,称取肝脏湿重,计算肝脏系数(肝脏系数=肝质量/体质量)。取肝右叶做 HE 染色,肝左叶制备 10%肝匀浆,匀浆制备方法:用冷生理盐水冲洗肝脏至无血色,称质量,加入 9 倍量冷生理盐水机械匀浆,将匀浆液 2 500 r/min 离心 20 min,4 ℃,取上清。
2.6 生化指标检测
每组取同等样本量的小鼠血清及肝匀浆,严格按照试剂盒操作方法进行小鼠血清 ALT、AST、TG、肝匀浆 MDA、GSH 含量测定。
2.7 肝组织病理学检查
取小鼠肝脏右叶置于10%中性福尔马林中进行固定,经一定梯度浓度的乙醇脱水、石蜡包埋、切片进行 HE 染色,用显微镜观察肝组织病理变化。
2.8 数据处理
应用 SPSS 19.0 统计软件进行统计分析,采用单因素方差分析,组间比较采用最小显着差数法(LSD),数据均以 x ±s 表示。