药用钩藤有五个种，分布在贵州省内的主要是毛钩藤和钩藤居多，在临床上通常用于降血压。因黄酮类成分具有一定降压作用，本实验采用紫外—可见分光光度法，三氯化铝显色后于 425 nm 波长处测定吸光度［1］，考察研究不同采收期、不同产地和不同种的药用钩藤中总黄酮的含量变化，为今后对钩藤的深入研究提供依据。
1 材料与仪器
紫外—可见分光光度计( 岛津 UV － 2501PC) ; AE － 240双量程电子分析天平，量程: 万分之一和十万分之一两档( 梅特勒 － 托利多上海有限公司) ; 超声波清洗器; 芦丁对照品( 批号: 100080 －200707) ，购于中国药品生物制品检定所; 无水乙醇、三氯化铝均为分析纯，水为蒸馏水。药材样品采自贵州省开阳县翁昭村钩藤种植基地毛钩藤和贵州省剑河县钩藤种植基地钩藤，样品药材均为人工种植五年或五年以上。经贵阳中医学院讲师付志明、副教授魏升华鉴定为茜草科植物毛钩藤( Uncaria hirsute Havil) ，钩藤( Uncaria rhyn-chophylla ( Miq． ) Miq． ex Havil． ) ，药材样品在室内阴干经粉碎后于 45℃烘至恒重并置于干燥器中备用。
2 方法与结果
2． 1 溶液的制备
2． 1． 1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品 3. 04 mg，置于 50 ml 量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为 60. 80 μg/ml 的对照品溶液。
2． 1． 2 三氯化铝溶液的制备 精密称取三氯化铝 12. 0717g，置于 500 ml 量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为 0. 10 mol/L 的三氯化铝溶液，备用。
2． 1． 3 供试品溶液的制备 取钩藤粉末 1 g，精密称定，置于 50 ml 具塞的锥形瓶中，精密加入无水乙醇 20 ml，称定重量，超声( 功率为 60%) 提取 30 min，取出，放冷，用提取液补足减失的重量，过滤，精密量取续滤液 2 ml，置 10 ml 容量瓶中，精密加入浓度为 0． 10 mol/L 的三氯化铝溶液 1 ml，混匀，加无水乙醇至刻度，摇匀，静置 15 min，即得供试品溶液。
2． 2 检测波长的确定
取供试品溶液和对照品溶液，按 2． 1． 3“供试品溶液的制备”项，从“精密加入浓度为0. 10 mol/L 的三氯化铝溶液1ml”起同法操作，进行显色，且同法作试剂空白，用紫外—可见分光光度计进行扫描，分别根据其光谱图知: 样品及对照品在 425 nm 处均有最大吸收峰，故本实验选择 425 nm 作为钩藤总黄酮的测定波长。
2． 3 线性关系考察
精密吸取浓度为 60. 80 μg/ml 的芦丁对照品溶液 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、4. 0 ml，分别置于 7 个 10 ml 的容量瓶中，各精密加入浓度为 0. 10 mol/L 三氯化铝溶液 1 ml，并加无水乙醇至刻度，摇匀，静置 15 min，同法作试剂空白，用紫外—可见分光光度计在 425 nm 的波长处测定吸光度，以对照品的浓度( μg/ml) 为横坐标( X) ，吸光度为纵坐标( Y) 进行回归计算，得到总黄酮的回归方程为: Y = 0. 0392X +0. 0104，r = 0. 9998。结果表明总黄酮在 3. 04 ～ 24. 32 μg / ml的范围内线性关系良好。
2． 4 精密度试验
精密吸取浓度为 60. 80 μg/ml 的芦丁对照品溶液 2 ml，按 2． 1． 3“供试品溶液的制备”项，从“精密加入浓度为 0. 10mol / L 的三氯化铝溶液 1 ml”起同法操作，显色后，分别进行吸光度测定，以 6 次测得的吸光度计算 ＲSD 为 2. 59%，表明仪器精密度良好。
2． 5 稳定性试验
精密吸取按“2． 1． 3”项下制备的供试品溶液，分别在 0、30、45、60、75、90 min 进行吸光度测定，以测得的吸光度计算ＲSD 为 2. 98% ，表明供试品溶液在 90 min 内稳定性良好。
2． 6 重复性试验
取 6 份 2012 年 3 月采收开阳翁昭人工种植毛钩藤样品粉末，每份 1 g，精密称定，分别置于 6 个 50 ml 具塞锥形瓶中，按“2． 1． 3”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外—可见分光光度计在 425 nm 处测定吸光度，计算出该钩藤药材中总黄酮( 按芦丁计) 的平均含量为 0. 08%，ＲSD 为 2. 95%。
2． 7 加样回收率试验
称取已知总黄酮( 按芦丁计) 的平均含量为 0． 08%的钩藤粉末6 份，每份0. 5 g，精密称定，分别置于50 ml 具塞锥形瓶中，每份分别精密加入浓度为 20. 00 μg/ml 的芦丁对照品溶液 20. 0 ml，按“2． 1． 3”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试液，同法作试剂空白，用紫外—可见分光光度计在 425 nm 处测定吸光度，计算出总黄酮的平均回收率为100. 75% ，ＲSD 为 2. 94% ，表明本法能够准确的测定中药钩藤中总黄酮的含量。结果见表 1。
2． 8 样品含量测定
按“2． 1． 3”项下“供试品溶液的制备”方法制备各供试液，每样平行 3 份，同法作试剂空白，用紫外—可见分光光度计在 425 nm 处测定吸光度，计算出总黄酮( 按芦丁计) 的含量，结果见表 2。
3 讨 论
根据实验数据看出，开阳毛钩藤在深秋至初春气温相对较低时钩藤中总黄酮含量相对较高且含量较稳定，而气温较高的 8、9 月份时钩藤中的黄酮含量相对较低，这与钩藤中生物碱含量随气温变化存在相似规律( 钩藤中生物碱含量随气温变化研究已另文报道) 。开阳毛钩藤和剑河钩藤虽不同种且产地不同，但两者总黄酮含量却没有较大差异。
本实验在考察提取溶剂时，根据相关文献的报道及黄酮类物质的性质，分别考察了不同浓度的乙醇［3，4］、先用乙醇提取再用乙酸乙酯萃取、甲醇及无水乙醇作为提取溶剂，只有无水乙醇提取出的供试液显色后在与芦丁对照品显色后在相同波长下有最大吸收峰，所以提取溶剂优选为无水乙醇。
参考文献:
［1］ 辛文波，王峥涛． 毛钩藤叶的化学成分［J］． 中国天然药物，2008，6( 4) :262 －264．
［2］ 伍俊妍，李国成，王定勇． 大叶钩藤非生物碱部分的化学成分研究［J］． 南方医科大学学报，2007，27( 2) : 226－ 227．
［3］ 郑嘉宁，王定勇． 大叶钩藤生物碱类化学成分研究［J］．中医药导报，2009，15( 1) :80 －86．
