决明子是一味众所周知的具有润肠通便功能的中药，具有调节血液和胆固醇作用，可用于治疗高血压、糖尿病、月经不调、水肿等疾病。望江南在中国称为草决明，在中国南方局部地区用于肠道和皮肤等病的治疗。而在加纳，草决明则用于治疗高血压、疟疾、伤寒、咳嗽等疾病。现代研究表明，草决明含有多种化学成分，如蒽醌类(番泻叶苷 A，B 和 C，芦荟大黄素，大黄酚，大黄素，大黄酸等)，三萜类、鞣质、黄酮类、油脂、毒白蛋白素和多糖等。有学者对源自湖北省和南京市的草决明的蒽醌含量进行了研究，发现湖北省的草决明蒽醌含量最高，且炮制时间和温度会影响挥发性成分的含量，而在加纳北方邦西部也出现过儿童因过量食用草决明而引起中毒的相关报道。目前对于决明子质量控制研究往往集中一个或几个成分的定性或定量分析，或采用双波长 HPLC 指纹图谱结合化学计量分析法鉴别炒决明子、生决明子和小决明子。而以多组分为基础的测定草决明的化学计量学分析方法研究尚未见报道。为控制药材质量，保证用药安全，本文根据草决明所含化学成分特性，对来自加纳和中国不同产地的 22 个草决明子样本中五种蒽醌类成分进行含量测定，并建立 HPLC 指纹图谱，为草决明的全面质量评价提供参考。
1 仪器与试药
1． 1 仪器:岛津( 日本东京) 二元 LC － 20AT 泵，SIL20A 自动进样器，CTO －10ASvp 柱温箱，SPD －20A 紫外检测器，CMB －20A系统控制器。
1． 2 试药:芦荟大黄素( ＞ 98． 0% ) ，大黄酸( ＞ 98% )，大黄素(＞ 99% ) ，大黄酚( ＞ 99% ) 和大黄素甲醚( ＞ 98． 4% ) 购自中国药品生物制品检定所。草决明样品产自加纳 11 个不同地区以及中国两个地区(武汉和南京)，并经李天祥副教授鉴定，标本保存于天津中医药大学实验室标本部(见表 1)。乙腈和甲醇(色谱纯)购自天津江天化工有限公司;甲酸(分析纯)购自天津柯伟有限公司。纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件:采用 Hypersil C18 色谱柱 (250mm × 4． 6mm，5μm，P． R) ，流动相:0． 05% 甲酸( A) － 乙腈( B)，梯度洗脱:0 －50min，5% B － 90% B;流速 1． 0mL / min，检测波长 254nm，柱温30℃ ，进样量 20μL。生品( NR) 、炒品( R) 和 5 个标准品混合物HPLC 色谱图如图 1 所示。【图1】
2． 2 溶液的制备:标准品溶液的制备:取芦荟大黄素(1mg) 、大黄酸(1mg)、大黄素(1mg)、大黄酚(1mg)和大黄素甲醚(5mg)精密称定，分别置于 10mL 的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为100μg / mL、 100μg / mL、 100μg / mL、 100μg / mL、 100μg / mL、500μg / mL 的标准品溶液。样品溶液的制备:采用传统炒制法进行炮制，在预热的平底锅(170 －190℃)中将 80g 草决明种子煨炒 4min，粉碎，过 4 号筛。
取草决明粉末样品(0． 2g)精密称定，置 10mL 容量瓶中加甲醇/水(4∶ 1)10mL。记录容量瓶质量，室温下将混合物超声萃取40min，补足失重。提取液经微孔滤膜(0． 45m) 过滤，取续滤液，待用。
2． 3 方法验证:精密量取 5 个蒽醌类化合物的标准品溶液适量，混合均匀，并逐级稀释绘制标准曲线，采用最小二乘法对每个蒽醌类化合物进行线性回归分析，结果表明线性范围内线性关系良好(R2 ＞0． 996)。精密度由同一天同一样品重复进样 6次测定，峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD，n = 6)分别小于 2． 5%和 0． 1%(表 3)。重复性通过分析 6 个平行制备的样品进行评价。稳定性通过分析相同混合标准溶液在室温下24h 的含量进行评价。加样回收试验结果表明，方法回收率介于 95．6% －104． 1%之间，RSD 小于 6． 2%。结果见表 2。【表2】
2． 4 含量测定:按“2． 2”项下方法制备样品溶液，经微孔滤膜 (0． 45μm) 过滤，进样分析。结果见表 3。【表3】
2． 5 草决明的 HPLC 指纹图谱的建立:按“2． 2”项下方法分别制备 22 个草决明药材的样品溶液，并按“2． 1”项下方法进样分析。比较各样品色谱图发现，不同样品具有相似的化学成分，在 HPLC 指纹图谱中，指认了 5 个色谱峰:①芦荟大黄素，②大黄酸，③大黄素，④大黄酚和⑤大黄素甲醚，保留时间分别为31． 7，32． 5，38． 1，43． 7，46． 7min。色谱峰 9 在色谱图上响应最高且保留时间适宜，因此选取作为参比峰。其中 7 个产自加纳的生品均有相应炮制品，分析生品(1 组)和炮制品(两组)色谱图，除了产自 Adum Banso 和 Ahinsan 的样品，每组 5 个样品都显示了大量共有色谱峰的存在，因此采用软件进行色谱峰匹配，结果 5 个生品样品显示有 16 个共有峰，5 个炮制样品显示有 8 个共有峰。如图 2 所示。
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)”，对产自加纳 5 个生品及与中国产生品进行相似度判别，结果见表 4、5。【表4略.表5】
3 讨 论
本实验建立了一种对草决明中的多个蒽醌类成分进行质量控制的简单可靠的 HPLC 法，同时建立的草决明指纹图谱标准，为该药材的质量控制提供依据。
3． 1 色谱条件的优化和提取方法的选择:为全面反映草决明药材 HPLC 信息，对提取溶剂和提取时间进行了考察，结果表明采用甲醇水溶液提取效果较好，并通过 L9(34)正交试验，考察甲醇/水在 20∶ 80、50∶ 50、80∶ 20 时超声提取效果。同时对色谱条件进行优化，比较甲醇、乙腈、甲酸、磷酸和水以不同比例作为流动相，结果表明乙腈比甲醇有更好分离效果;检测波长在 254nm 和278nm 时具有相似的色谱图，但278nm 下大黄素甲醚响应较弱，因此选取 254nm 作为检测波长;流速为 1mL/min时，50min 内具有良好分离效果。
3． 2 指纹图谱的应用:产自 Okponglo sonitra 的炮制品在加纳的 11 个样品中蒽醌类化合物含量最高。与产自土壤条件相似的 Physic garden (KNUST)样品相比，相似度可达 0． 955;与两个产自中国的炮制品相比，相似系数分别为南京(0． 215)、武汉(0．335)。表明产自两个国家的样品具有显着的差异。
3． 3 生品和炮制品的使用的差别:比较生品和炮制品的色谱峰的差别，结果色谱图上共有34 个色谱峰。其中5 个色谱峰为生品特有，但炒制后都消失。炒制后产生 19 个新的色谱峰，其它有 8 个色谱峰吸收增强，2 个色谱峰吸收下降。推测新色谱峰可能是在炒制过程中经氧化或分解产生。
参考文献:
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［2］ 南京中医药大学． 中药大辞典［M］． 第 2 版． 上海:上海科学技术出版社，2006．3133 －3134
［3］ Chu C，Hao Z，Wei X，et al． 2007． High － performanceliquid chromatographicngerprint analysis for different originsof sea buckthorn berries［J］． Journal of Chromatography A，1154:250 －259．
