2.4 标准品稀释缓冲液的优化【3】
从图3可以看出，随着甲醇体积分数的增大，ELISA最大光密度值无明显变化，但ELISA方法IC50值逐渐增大，表明高体积分数的甲醇对BPA抗体竞争抑制效率有明显影响，因此选用超纯水作为标准品稀释缓冲液。
2.5 抗体稀释缓冲液pH值的优化
从图4可以看出，随着pH值的增大，最大光密度值逐渐降低，IC50值也逐渐减小，可能是由于较高的pH值会对抗原抗体的结合具有干扰作用，虽然pH值为6.4时，光密度值最大，但IC50值最大，结合标准曲线的相关系数，pH值为7.4时相关系数最大，所以选择缓冲液pH值为7.4比较合适。【4】
2.6 ELISA标准曲线的建立
BVA-OVA包被质量浓度为1 μg/mL,抗体最终稀释比例为1∶512 000,酶标二抗浓度为1∶2 500时，建立BPA间接竞争抑制曲线。抗体在1~50 ng/mL之间具有良好的线性，线性方程为y=-0.339x+1.116,相关系数R2=0.995,抑制率为50%时，BPA的质量浓度为6.56 ng/mL.一般选择抑制率为10%对应的质量浓度为最低检测限，该方法的最低检测限，即IC10为0.43 ng/mL.
2.7 交叉反应率的测定
将单抗分别与双酚S、BVA、对苯二酚和邻羟基苯甲酸进行间接竞争ELISA,测定IC50值，并计算交叉反应率，结果见表1.双酚S交叉反应率为0.29%,BVA交叉反应率为0.25%,对苯二酚和邻羟基苯甲酸的交叉反应率均小于0.066%.4 种物质的交叉反应率均小于1%,对BPA的检测几乎无干扰。实验结果表明，本实验室制备的3H1单克隆抗体对BPA具有较好的特异性。【5】
采用间接竞争ELISA方法检测矿泉水中BPA含量，以未检出BPA的矿泉水进行BPA加标实验。结果见表2,显示BPA回收率为82.83%~101.94%,变异系数为2.94%~12.95%.
3 讨论与结论
BPA作为重要的化工原料，广泛应用于生活中。因其具有多种毒性作用，对人类的健康造成严重的危害。世界各国针对BPA的残留制定了相应的残留标准并建立了各种分析方法，进行严格监管。目前，ELISA方法已被广泛应用于BPA的快速检测，而建立高灵敏的ELISA法的关键在于特异性抗体的制备。如果要制备高亲和性和特异性的抗体，选用的半抗原分子的反应基团应远离其特征结构，如羧基、氨基、羟基、苯环和杂环等，使半抗原特征结构充分暴露。BPA分子上具有两个羟基基团，在半抗原分子的两个苯环上，不适合用作反应基团与载体大分子偶联制备人工抗原。
本研究选用了BPA的结构类似物BVA作为半抗原引入了羧基，采用活泼酯法制备了人工抗原，使BPA分子中的特征结构充分暴露。用抗原免疫BALB/c小鼠，对免疫抗原的剂量和免疫程序进行了优化，首次免疫抗原剂量为80 μg/只，隔3 周进行加强免疫，免疫剂量为55 μg/只，共免疫3 次。第3次免疫后筛选出血清效价和特异性较高的小鼠。采用聚乙二醇法进行细胞融合，经过3 次筛选，成功获得一株分泌抗BPA单克隆抗体的细胞株3H1,并应用制备的单克隆抗体初步建立了BPA的间接竞争ELISA方法，线性范围为1~50 ng/mL,最低检测限为0.43 ng/mL,IC50为6.56 ng/mL.回收率为82.83%~101.94%,变异系数为2.94%~12.95%.本方法简便、灵敏、快速，可用于检测水体中的BPA污染情况，具有较好的应用前景。
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