随着人类和真核生物基因组测序完成，现代基因工程学已经步入后基因组时代[1].面对核酸、蛋白序列及结构数据资源增长，生物信息学应运而生并逐步发展，逐渐成为生命科学在信息时代的核心内容 之 一[2].本 试 验 将 绵 羊 骨 形 态 发 生 蛋 白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）基因通 过NCBI BLAST、Protparam、Protscale、NetPhos 2.0Server、InterProscan、DNAStar、TMHMM Serverv.2.0、PsortⅡ、SignalP等多种生物信息学软件来进行同源性比对分析并推测编码蛋白的理化性质、疏水性、磷酸化位点、保守功能结构域、二级结构、跨膜区、亚细胞定位及信号肽，并用SWISS-MODELWorkspace来预测三维结构。通过对BMP4编码蛋白结构和功能的预测和分析来为更近一步的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1数据来源
绵羊BMP4基因序列来源于绵羊皮肤转录组测序结果[3]
,各物种的BMP4基因序列来源于NC-BI,GenBank登录号分别：藏羚羊XM_005968646、小鼠NM_007554、野骆驼XM_006185423、美洲驼XM_006199839、人NM_130851、牛XM_005211793、猪XM_005659971、山 羊NM_001285646、马NM_001163970、家兔NM_001195723、鸡NM_205237.
1.2生物信息学分析
利用NCBI的BLASTn软件对BMP4基因进行序列同源性比对分析。运用NCBI的ORF Find-er进行开放阅读框（open reading frame,ORF）分析并获取编码蛋白的氨基酸序列，运用DNAMAN软件分析绵羊BMP4与各物种BMP4的进化关系，构建了各物种间BMP4的系统 进化 树。利用Prot-param工具对绵羊BMP4基因编码蛋白进行分子质量、等电点预测 .利用Ptotscale工具对绵羊BMP4基因编码蛋白进 行 疏 水 性 分 析。利用TMHMM Server v.2.0软件进行跨膜区域分析。信号肽是决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸残基修饰的一些肽段，蛋白的定位是通过信号序列引导实现的，信号序列通常为15-60个氨基酸长度，位于新生肽的N端，利用SignalP软件进行信号肽分析 （.保守功能结构域检索利用NCBI网站上的Conserved Domain Search工具 及EBI网站上的InterProscan[4]工具进 行。
运用ExPaSy软件中的NetPhos 2.0Server对蛋白磷酸化位点进行预测[4].运用PsortⅡ软件分析该蛋白的亚细胞定位 [5].分析位置功能域或新发现蛋白分子的结构并预测其功能单位或结构域，可为已有蛋白的改造或新蛋白的设计提供依据，为新基因结构和功能的预测提供参照，采用DNAStar软件预测二级结构，运 用SWISS-MODEL Workspace预测三维结构。
2 结果与分析
2.1 BMP4的ORF分析对BMP4的cDNA
进行序列统计分析，结果见图1.由图1可知，BMP4基因序列包含完整的CDS区，有 一 个 完 整 的ORF.ORF位 于422-1 651bp,长度为1 230bp,共编码409个氨基酸，得到编码蛋白的氨基酸序列，以便后续试验对BMP4进行各项分析。
2.2物种间同源性比对分析
将BMP4的cDNA序列在GenBank数据库中比对，结果发现其与已公布的藏羚羊BMP4基因序列（登录号：XM_005968646）同源性为99%,与小鼠（登录号：NM_007554）同源性为92%,与野骆驼（登录号：XM_006185423）同源性为97%,与美洲驼（登录号：XM_006199839）同源性为96%,与人（登录号：NM_130851）同 源 性 为95%,与 牛 （登 录 号：XM_005211793）同 源 性 为99%,与 猪 （登 录 号：XM_005659971）同源性为96%,与山羊（登录号：NM_001285646）同 源 性 为99%,与 马 （登 录 号：NM_001163970）同源性为95%,与家兔（登录号：NM_001195723）同 源 性 为94%,与 鸡 （登 录 号：NM_205237）同源性为79%.用DNAMAN软件构建绵羊BMP4与其他几个物种之间cDNA序列的系统进化树，结果见图2,各物种BMP4基因部分保守区域比对分析见图3.由图2、3可知，除了与鸡（登录号：
NM_205237）的BMP4基因同源性较低外，与 其 他 几 个 物 种 均 具 有 很 高 的 同 源 性，且BMP4基因在各物种之间的保守区域位于cDNA序列的前10-390位碱基之间。
2.3 BMP4编码蛋白的理化性质分析
利用Protparam工具对蛋白理化性质进行分析，结 果 显 示BMP4编 码 蛋 白 的 分 子 式 为C2058H3234N622O596S16,原子总数为6 526,相对分子质量为46 739.0,理论等电点为8.73,氨基酸总数为409个。在氨基酸组成上，亮氨酸（Leu,L）最多，有39个，占9.5%;精氨酸（Arg,R）其次，有37个，占9.0%;色氨酸（Trp,W）最少，有6个，占1.5%.总的带负电残基（Asp+Glu）为46,总的带正电残基（Arg+Lys）为51.其消光系数在280nm时 为49 890,不稳定系数为59.96,说明BMP4蛋白是一个不稳定蛋白；脂肪系数为80.54,总平均亲水性为-0.553,说明BMP4蛋白是一个亲水蛋白。
2.4 BMP4编码蛋白的疏水性分析
利用Protscale软件分析蛋白疏水性质，结果显示整条多肽链表现为较强的亲水性，其中第305位的精氨酸（Arg,R）具有最低的分值（-3.200），亲水性最强；多肽链的第18位的异亮氨酸（Ile,I）具有最高的分值（1），疏水性最强，推断BMP4蛋白是一种可溶性的蛋白（图4）.
2.5 BMP4编码蛋白的功能域预测
用NCBI Conserved Domain Search工具结合EBI网站的InterProscan工具预测BMP4编码蛋白的功能域。
BMP4编码蛋 白含有2个功能域，即TGF-β超家族和TGF-β前肽超家族，无跨膜区（图5）.
TGF-β超家族为编码蛋白的活性区域，位于309-409位氨基酸处，它是控制许多细胞增殖、分化及其他功能的多功能肽。
TGF-β前肽超家族位于38-276位氨基酸处，与C末端生物活性区以非共价键结合形成LAP.
2.6 BMP4编码蛋白的二级结构预测
用DNAStar软件预测BMP4编码蛋白的二级结构，预测图见图6,蛋白的二级结构是它的生物基础。
2.7 BMP4编码蛋白的信号肽分析
本研究采用蛋白序列信号分析工具SignalP对BMP4编码蛋白进行了分析，并得到3种C、Y、S值计算结果。对于一个典型的信号肽，C值和Y值趋向于+1,S值在剪切位点之前高，而在剪切位点之后变低。由图7可知，编码产物的分值曲线非常典型，C值为0.554,Y值为0.694,S值为0.953,可能的剪切位点位于24和25位氨基酸之间，基本可以判定BMP4编码蛋白存在信号肽。
2.8 BMP4编码蛋白的跨膜区预测和亚细胞定位
TMHMM Server v.2.0是一款预测和分析蛋白跨膜区域的功能软件。通过TMHMM Server v.2.0预测蛋白跨膜区，结果显示无跨膜区（图8）。利用PsortⅡ分析BMP4编码蛋白的亚细胞定位，结果显示47.8%位于细胞核、13.0%位于细胞外（包括细胞壁）、13.0%位于细胞支架、8.7%位于细胞质、8.7%位于线粒体、4.3%位于空泡、4.3%位于分泌腺系统，所以推测该蛋白很可能定位于细胞核中。
2.9 BMP4编码蛋白的磷酸化位点预测运用ExPaSy软件中的NetPhos 2.0Server对蛋白进行分析，结果显示BMP4编码蛋白具有18个磷酸化位点，其中色氨酸（Ser,W）位点12个、苏氨酸（Thr,T）位点3个、酪氨酸位点（Tyr,Y）3个（图9）.
2.10 BMP4编码蛋白的三维结构预测应用SWISS-MODEL Workspace平台对BMP4编码蛋白的三级结构进行预测，选择3bmp.1.A（303-409）作为模板蛋白，结果显示预测出的三维结构氨基酸序列与模板蛋白同源性达到了88.29%（图10）.
3 讨论
生物信息学技术分析基因序列所含的遗传信息，研究基因所控制形成的蛋白产物，并揭示表达的生物学意义[6].对绵羊皮肤转录组测序结果得到的BMP4基因序列的cDNA进行序列统计分析，结果发现BMP4基因序列包含完整的CDS区，有一个完整的ORF.
ORF位于422-1 651bp,长 度 为1 230bp,共编码409个氨基酸。将绵羊BMP4的cDNA序列与GenBank中其他物种BMP4基因进行序列比对和系统进化树分析，结果发现与其他物种都具有很高的同源性，其中与藏羚羊和牛具有最高的同源性，为99%;与鸡具有最低的同源性仅为79%.通过理化性质分析得出BMP4编码蛋白的分子式为C2058H3234N622O596S16,原子总数为6 526,相对分子质量为46 739.0,理论等电点为8.73,氨基酸总数为409个。绵羊BMP4编码蛋白是一个不稳定的亲水蛋白，不存在跨膜区，很可能位于细胞核中，且存在信号肽。编码蛋白具有18个磷酸化位点，通过功能域的预测发现编码蛋白含有2个功能域，即TGF-β超家族和TGF-β前肽超家族，无跨膜区。这与BMP4基因家族的功能相一致，证明了绵羊BMP4是一种生长因子，具有信号传导功能。蛋白三维结构预测结果与模板蛋白3bmp.1.A同源性达到了88.29%.1374已有研究结果表明，BMPs是一组能在骨骼外异位诱导软骨和骨形态发生的分泌型蛋白，其成员不少于20种[7-8].BMPs不仅能诱导成骨，而且在胚胎发育、神经、造血组织、皮肤附属物等的形成和分化中都起重要作用[8].多项研究报道，在一些动物的卵巢、前列腺、皮肤及其衍生物等组织中检测到BMPs,BMPs及其受体在毛囊发育过程中具有重要作用，且 主 要 起 抑 制 性 作 用[9-11].研 究 结 果 表 明BMP4基因是影响皮肤和毛囊发育的一个关键候选功 能 基 因[12].它 也 是TGF-β超 家 族 中 的 一员[12],TGF-β超家族由一大类具有共同结构特征的细胞因子组成，在物质代谢、细胞增殖、分化、黏附和凋亡及生物各种组织器官生长发育中都发挥着极其重要的作用[8,13].综合生物信息学软件分析得出绵羊BMP4的各种生物学特性及科学研究已经得出的BMP4性质可以为以后在科研实践中深入研究BMP4功能提供依据和方向。【图略】
参考文献：
[1]Hubbard M J.Functional proteomics:The goalpostsare moving[J].Proteomics,2002,2（9）:1069-1078.
[2] 程博涵，冷丽，李辉.鸡BMP4的结构与功能分析[J].东北农业大学学报，2013,44（9）:18-22.
[3]Fan R W,Xie J S,Bai J M.Skin transcriptome profilesassociated with coat color in sheep[J].BMC Genom-ics,2013,14:389.
[4] 张香美，李平兰.类植物乳杆菌L-XM1 plnBCD基因的生物信息学分析 [J].中国农 业 大 学 学 报，2013,19（3）:175-179
