摘 要
本研究以鲤鱼和七水合硫酸锌为实验材料制备多肽锌螯合物，即将鲤鱼肌肉蛋白经过风味蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解获得多肽，并将此多肽与七水合硫酸锌按一定的条件进行螯合以制备相应的多肽锌螯合物。主要探讨了鲤鱼多肽锌螯合物的制备工艺条件及其生物活性。以抑菌圈直径大小为评价指标，研究了鲤鱼多肽与锌的质量比、螯合反应的p H、时间和温度对螯合物抑菌活性的影响，从而全面优化制备多肽锌的工艺条件。
经过正交试验最终确定了获得鲤鱼多肽锌螯合物的最佳工艺条件为肽锌质量比1:1、螯合反应p H 5.5、反应时间40 min、反应温度55℃。此条件下的螯合物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有显着抗菌性，其抑菌圈直径分别为13.00 mm和13.33 mm，此条件下螯合率为47.3 %。对最佳螯合产物进行分离纯化后测得其对两菌的抑菌效果均有所提高，抑菌圈直径都达到了14 mm,其抗氧化能力几乎为未螯合多肽的2倍，达到生育酚抗氧化活性的60.50 %。红外光谱分析进一步证明多肽与锌螯合成新产物。
关键词 ： 鲤鱼 多肽锌螯合物 制备工艺 抗菌性 抗氧化。
Abstract
This research used carp and zinc sulfate heptahydrate as experimental material, obtainedpolypeptide from carp muscle proteins by composite enzymatic hydrolysis with papain andflavored proteinase, then made peptides and zinc according to certain conditions to produce thecorresponding polypeptide-zinc chelates. It focuses on the preparation technology and biologicalactivity of polypeptide-zinc chelates. Using inhibition zone diameter as evaluation, this paperstudied the effects of mass ratio, p H, time and temperature in chelation reaction on theantibacterial activity of chelates in order to fully optimize the process conditions for polypeptide-zinc. By orthogonal test, the optimal conditions were determined: the mass ratio of peptide tozinc 1:1, p H 5.5, time 40min, temperature 55℃in chelation reaction.Under these conditions, thechelates has significant antimicrobial properties to Escherichia coli and Bacillus subtilis, theantibacterial diameter was 13.00 mm and 13.33 mm, respectively. In addition, the chelating ratewas 47.3% in these conditions. After purified,the optimal chelation’s bacteriostatic effect on twostrains were all improved and reached 14 mm, its antioxidant capacity was almost twice thepolypeptide and reached 60.50% of tocopherol. Infrared spectroscopy was further proved thatpolypeptide and zinc chelate into a new product.
Key words : carp; polypeptide-zinc chelates; preparation technology; antibacterial activity;antioxidation。
1、引言
一些金属元素特别是微量元素，它们在人体内含量虽少[1]，但对人体有特殊的生理功能和营养作用，对维持机体的生长发育及繁殖等不可缺少，与机体的疾病和健康有着非常密切的关系[2]。由于人体不能自身合成微量元素，且目前世界上人们普遍存在缺铁、缺钙、缺锌等现象，故开发安全的金属元素补充剂具有重要意义。一些微量金属元素可与多肽结合形成螯合物，这些多肽金属螯合物除了具有营养性强、吸收快、生物效价高、能补充微量元素需要等优点外，还有抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫调节等活性[2]，因此具有很大的开发价值和研究意义，也逐渐成为国内外研究热点。
1.1、鲤鱼简介。
鲤鱼，俗称鲤拐子、鲤子，学名Cyprinus carpio，是鲤鱼目鲤鱼科属的淡水鱼，原产亚洲[3]。其鳞大，上颚两边各有二须，通常是单独或以小群的形式生活在水草丛生且平静的河流、池塘或湖泊中[4]。鲤鱼属杂食性底层鱼类，生长快，个体大，主要吃河蚬、螺蛳、水蚯蚓、摇蚊幼虫、水生昆虫和虾等，也吃水生高等植物的种子、幼芽、有机碎屑和各种人工精饲料[3]。鲤鱼是我国重要的淡水养殖鱼类，养殖历史较久且范围较广[5]。鲤鱼因产量高、抗病力强、耐低氧[6]，其蛋白质含量高、氨基酸组成比例平衡[7]且鲤鱼蛋白经酶解得到的小肽有吸收快、营养平衡、易于利用的特点[8]，故具有较大的开发潜力和研究价值。
1.2、多肽与金属离子螯合机理。
相关研究发现，多肽与金属离子间主要是通过配位作用形成螯合物，主要是通过多肽两端的氨基、羧基和肽链中的羰基、亚氨基以及侧链氨基酸的某些基团与金属离子在一定条件下配位结合而成[9]。杨粢等[10]对低值鱼蛋白多肽和其与钙的螯合物进行红外光谱测定分析，结果表明Ca2+与多肽的氨基、羧基等都发生了较强的配位结合。另外，也有报道认为多肽与金属离子间除了配位结合还有离子键结合和多肽对金属离子的吸附[11]。
此外，多肽金属螯合物多以环状形式存在，这是由一个多肽中含有多个配位原子及这些原子与金属离子间以多个配位键结合决定的[12]。
1.3、多肽金属螯合物的制备方法及结构分析。
目前，随着对多肽金属螯合物的研究越来越深入，其制备方法也逐渐成熟，主要有三步：提取蛋白、酶解蛋白获得多肽、将多肽与金属离子进行螯合。提取的蛋白一般都为天然蛋白，期望通过研究提高这些蛋白的利用率。制备多肽通常有酶解法、化学合成法和溶剂提取法[2]，但相比而言酶解法更安全、成本更低、更易操作，故成为主要使用方法。螯合过程中有很多因素会影响螯合产量或螯合物活性，如酶解工艺、多肽与金属离子质量比、螯合反应的p H、温度和时间，对这些影响因素进行研究就可以优化制备高生物活性的螯合物。如姜良萍等[13]探讨了鲢鱼源多肽锌制备工艺对其抑菌活性的影响，结果表明，制备抑菌型鲢鱼多肽锌的最佳工艺条件为风味蛋白酶酶解6 h、多肽与氯化锌质量比2:1、反应p H 6.0、时间45 min、温度30℃，在此条件下获得的螯合物有较好的抑菌性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别是12.50 mm和12.66 mm。
多肽金属螯合物结构会因水解所得多肽的复杂而变得复杂，故为研究螯合机制或螯合位点，有必要对其结构进行分析[14]。常用的螯合物结构分析方法有紫外吸收光谱法、红外吸收光谱法、X射线衍射、原子力显微扫描、核磁共振、空间结构分析等方法[14]。
【由于本篇文章为本科论文，如需全文请点击底部下载全文链接】
1.4、多肽金属螯合物的生物活性.
1.4.1、促进金属离子吸收.
1.4.2、抗氧化活性
1.4.3、抗菌活性
1.4.4、其它生物活性.
1.5、研究目的与意义. .
2、材料与方法
2.1、材料与试剂.
2.2、仪器与设备
2.3、实验方法
2.3.1、鲤鱼肌肉蛋白的酶解
2.3.2、多肽锌螯合工艺优化及最佳参数确定
2.3.3、多肽锌螯合物分离纯化
2.3.4、多肽锌螯合物定性鉴定
2.3.5、多肽锌螯合物抗氧化能力测定
2.3.6、多肽锌螯合物抑菌活性测定
2.3.7、多肽锌螯合物红外光谱测定
3、实验结果分析
3.1、螯合工艺的优化
3.1.1、多肽与锌质量比对螯合物抑菌活性的影响
3.1.2、螯合pH对螯合物抑菌活性的影响
3.1.3、螯合时间对螯合物抑菌活性的影响.
3.1.4、 螯合温度对螯合物抑菌活性的影响
3.1.5、正交试验设计.
3.1.6、正交验证试验，
3.2、多肽锌螯合物分离纯化结果
3.3、多肽锌螯合物定性鉴定结果
3.4、多肽锌螯合物抗氧化能力确定
3.5、多肽锌螯合物抑菌能力确定
3.6、多肽锌螯合物红外光谱分析
4 、总结
本实验主要通过单因素和正交试验，以抑菌能力为指标研究了鲤鱼白肉经木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合水解后得到的多肽与锌离子螯合的最佳制备工艺及其螯合物的抗菌、抗氧化等生物活性，并借红外光谱研究了多肽螯合锌后结构的变化。从以上的实验结果可以得出，当多肽与锌以质量比1:1，p H 5.5,反应时间40 min，温度55℃进行螯合得到的鲤鱼多肽锌螯合物具最佳的综合抑菌效果，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为13 mm和13.33 mm。将经最佳螯合工艺制得的多肽锌螯合物过凝胶柱进行分离纯化，并收集峰值对应管内样品溶液，冷冻干燥成冻干粉后测其抗氧化和抗菌活性。抗菌实验表明，纯化后多肽锌对两菌的抑菌直径均有所提高。抗氧化实验结果表明，鲤鱼多肽与多肽锌螯合物和生育酚比较都具有一定的抗氧化能力，但多肽锌的抗氧化能力明显高于未螯合多肽，达到生育酚抗氧化活性的60.50 %，有望作为一种安全的抗氧化剂应用于化妆品或食品中。红外光谱测定结果进一步证实多肽与锌发生了螯合。
本实验制备的螯合物最佳抑菌效果略高于姜良萍等[13]将鲢鱼源多肽与锌螯合所得产物的最佳抑菌效果(对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为12.50 mm和12.66mm），而低于杨燊等[10]制备的低值鱼蛋白多肽-钙螯合物的抑菌活性（对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径均为16 mm）。而且各自的最佳螯合条件不同，这可能是由原料不同、多肽氨基酸组分不同引起的，从而各自具有不同的抑菌活性。此外，本实验制备的鲤鱼多肽锌螯合物的抗氧化活性也低于杨燊等[10]制备的低值鱼蛋白多肽-钙螯合物，他们测得螯合物的抗氧化作用较显着，相当于生育酚的94.43 %。通过与前人的研究对比发现，关于鲤鱼多肽金属螯合物的研究还需进一步加深，例如研究不同的金属与鲤鱼肌肉多肽螯合可能会使螯合物生物活性增强，也可用不同的指标来确定最佳螯合工艺。
在实验过程中，为保证实验数据的可靠性，进行了多次平行实验，并在实验中不断地总结失误经验，避免错误的再次发生。总结的经验主要有：对一些操作不太熟练的设备要仔细阅读相关说明书，并多次练习操作；实验中不懂的地方要积极地向老师请教或多查阅文献资料；因螯合实验量大、较费时，所以，为节约时间，在一组螯合的同时为下组做准备；要严格按照所需的条件进行螯合，不能因大意而忘记控制任一变量；调节螯合反应p H时要注意滴加HCl或Na OH的量，否则容易调过；使用离心机前一定要注意离心管的配平且离心管一定要对称放，否则易损坏离心机；无菌操作不规范很容易导致抑菌圈实验的失败，故一定要注意器具的灭菌及无菌操作的规范性。总之，为避免实验失误或实验误差，实验过程中一直小心谨慎，并通过大量的重复实验来获取最可靠的实验结果。
本实验关于多肽锌螯合物的研究不仅有利于鲤鱼蛋白的加工利用，还为开发安全、高效的微量元素补充剂、抗菌剂或抗氧化剂提供了一定的理论依据，但关于多肽锌螯合物生物活性机制的研究还不是很多，还需进一步深入探讨，相信这将会成为今后的研究热点，这也将为鲤鱼多肽锌螯合物在食品、化妆品、医药等领域提供更广阔的应用前景。
参考文献
[1]施雪燕宽体金线蛭多肽锌螯合物的制备及活性研究D]常熟:常熟理工学院，2015.
[2]刘温,楼乔明，杨文鸽.多肽金属元素整合物研究进展[]食品与发酵工业2014, 40(4): 142-
[3] 亚丽.鲤鱼的生长特性及养殖方法[J].养殖技术顾问, 2013(2): 216-216.
[4] 王立斌鲤鱼的养殖及经济价值[J]. 商场现代化，2008(31): 328-328.
[5]钟立强，张成锋,周凯，等.四个鲤鱼种群遗传多样性的AFLP分析J]基因组学与应用生物学,2010, 29(2): 259-265.
[6]黎显明，黄安翔.鲤鱼的特性与规模化养殖要点[].养殖技术顾问，2012(1):260-260.
[7]朱健，王建新,龚永生,等几种鲤鱼肌肉的--般营养成分及蛋白质氨基酸组成的比较[J].湛江海洋大学学报, 2000, 20(4).9-12.
[8] 施佳慧,朱加进，陈文聪，等鲐鮁鱼水解产物抗疲劳作用效果研究[J]. 中国食品学报,2010,10(6): 77-80.
[9]方细娟,曾庆祝,战宇,等多肽~金属元素配合物的研究进展及发展前景[J].食品工业科技,2012, 33(4): 413-416.
[10]杨荣，邓尚贵,秦小明低值鱼蛋白多肽钙螯合物的制备和抗氧化、抗菌活性研究[]食品科学，2008, 29(1): 202-206 .
[11] 王子怀，胡晓，李来好，等肽-金属离子整合物的研究进展[J]. 食品工业科技, 2014, 35(8):359- 362.
[12] 曾庆瑞，韩曜平,刘晶晶，等.多肽微量元素整合物的研究进展[]化学与生物工程，2016,33(1): 17- 20.
[13] 姜良萍，李博，罗永康,等鲢鱼源多肽锌的制备工艺对其抑菌活性的影响[]食品科技, 2013,38(2): 125-1 30.
[14] 汪靖瑜,张业辉，刘学铭,等动物性短肽螯合物研究进展[]食品科技, 2015, 40(10) 236-240.
[15] 郑炯,汪学荣，阚建全血红蛋白多肽整合铁的抗贫血功能研究[]食品工业科技, 2009,30(10): 312-313.
[16]Adam son N J, Reynolds E C. Relati onship between degee of casein hydrolys s and phosphopeptiderelease[J]. Journa1 of Dairy Research, 1997, 64(04): 505-514.
[17]KatoT, Sugawara A, H osada N. C alcium carbonate- orgari c hybrid m aerials[]. Advanced Material,2002, 14(12): 869-877.
[18]EvansL T. Crop physiology. same case histories[M] CUP Archive, 1975.
[19] RERAT A, NUNES C s, MENDY F, et al. Am ino acid absorpti on and production of pancreatichorm ones in non- anae sthetized pigs after duodenal infusi ons of a milk enzymic hydlrolysate or of free aminoacids[J1. The Briti sh Jounal of Nutntion 1988. 60(1): 121-136.
[20]林慧敏,张宾,邓尚贵,等舟山海域4种低值鱼酶解蛋白亚铁螯合物自由基清除活性与抑菌活性研究[J]中国食品学报, 2012, 12(1): 19-23.
[21]DASHPER S G, LIU S w, RE YBNOLDS E C. Antimnicrobial peptdes and their potantial as aralther apeutic agents[]. Int emational J oumnal of P eptide R esearch and Therapeutics, 2007, 13(4): 505-516.
[22]霍健聪，邓尚贵,童国忠鱼蛋白酶水解物亚铁整合修饰物抑菌特性及机理研究[J]中国食品学报, 2010, 10(5): 83-89 .
[23]王秀丽，刘安军,李琨,等胶原蛋白多肽-铬(I)螯合物的降血糖机理探讨[J].食品研究与开发, 2006, 27(5): 125-126, 48.
[24]刘安军，张旭，张固蓉,等胶原蛋白多肽~铬(皿)螯合物对小鼠的免疫调节作用[J]现代食品科技, 2008, 24(5): 401 404, 408 .
[25]刘安军，王维君,曹东旭，等胶原蛋白多肽_铬(M)整合物对小鼠肝脏SOD表达的影响[J]食品研究与开发2007, 28(12): 22-25.
[26]DONG Shiyuan ZENG Mingyong WANG Dongfeng et al. Antiox idant and biochemical pr opertiesof pr otein hydrolysates prepared fromn Silver carp (Hypophthalmi chthrys m otix)[P]. F ood Chemisty, 2008,107: 1485-1493 .
[27] wU Jincha, HUANG Guangrong YU Mia, et al. Preparation of ang otensin canveting enzyme(ACE) inhibitary peptides fron silver carp (Hypoplhthalmichthys mltix)[G]. 2001 Inenational Confer enceon Human H ealth and Biomedical Engineering Jilin China, 2001, (8): 19-22.
[28]高红梅,桑宏庆,李淑贤.小麦肽-锌整合物的制备[]、饮料工业2013(7): 23-26.
[29] ZHU K X, WANG X P, GUO X N. Isal ation and characteriz ati on af zinc- chel ating peptides fromwheat germ protein hydolysates[J]. Journal of Functianal Foods, 2015, 12: 23-32.
[30]霍健聪，邓尚贵,谢超。带鱼下脚料蛋白多肽亚铁螯合物的制备及抗氧化活性研究[]食品工业科技, 2009, (4): 267-270 .
[31]吴茹怡，曾里,曾凡骏:复合氨基酸螯合物鉴定方法的研究[]食品科技, 2006(3): 104 107,112.
[32]JEON Y J, BYUN H G, KIM S K. Improvem ent of functional properties of cod frame protein hyd alysate s using ultrafiltration m em br anes[J] Process Biochemisty, 1999, 35: 471 -478.
[33]杨姗姗罗非鱼皮多肽锌螯合盐的制备及性质研究[D]南昌:南昌大学,2008.
[34]赵洪雷，徐永霞，杨杰等低值鱼小肽螯合锌的制备工艺研究[J].食品科技2009, 34(9): 117-119.
[35]高素蕴，潘思轶,郭康权.大豆分离蛋白水解物螯合锌(I)的合成与制备[].食品科学, 2003,24(10): 117-120.
[36]许庆陵，曾庆祝,闫磊，等罗非鱼多肽-锌配合物的制备及其生物活性[J].食品科学,2010,31(10): 75-80.
[37]霍健聪，邓尚贵,谢超。多肽亚铁整合物制备及抑菌活性研究[J].食品与机械2009,25(1):86-.89.
