饥饿可以定义为驱动个体寻找和消化食物的感觉或动力[1].摄食及觅食行为是动物的最基本行为，以嗅觉系统为导向是啮齿类动物觅食的重要特点，嗅觉系统的基本构成包括位于嗅粘膜上的感觉神经元，大脑前端的嗅球，以及嗅皮层，嗅皮层中最关键部分为梨状皮层[2].感觉神经元及嗅球最主要的功能是对不同的气味分子进行识别，并形成精确的空间定位[3].嗅皮层主要完成对嗅觉信号的整合，形成嗅觉记忆，并把特定嗅觉信号和其他诸如颜色、味道、形状、空间位置等感觉信息进行整合[4].
动机的形成有先天遗传，也有后天的经验和学习，但均依赖于脑内特定的神经环路及递质系统[5].动物的觅食动机和其饥饿状态密切相关，饥饿状态下动物的觅食动机增强，反应在嗅觉系统对食物发出的气味分子更加敏感，探索行为更加强烈[6].但对于饥饿状态下，动物觅食行为的反应和梨状皮层的关系尚不清楚。本实验以大鼠为研究对象，利用食物埋藏，观察大鼠饥饿状态下依赖嗅觉的探索行为的变化，在此基础上，利用荧光金标记技术观察嗅球到梨状皮层的投射变化，利用 c-fos 标记技术研究梨状皮层神经元活化水平。
材料和方法
1 材料
雄性 SD 大鼠 16 只，体重 250 ~300 g,由兰州大学基础医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合 2006 年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。脑立体定位仪（ 成都泰盟公司，DW-2000 脑立体定位仪） 、冰冻切片机（ Ther-mo,Cryotome E ） 、抗 c-fos 一 抗 （ Sigma,A40215,1∶ 500） 、荧光显微镜 （ Olympus,DP22） 、偶联 cy3 二抗（ Bioss,bs-0296a-cy3） .
2 方法
2. 1 动物和分组 雄性 SD 大鼠 16 只，安静环境饲养，12 小时光照周期，温度 22 ~ 25 ℃，湿度 65 ~75% 之间，自由摄食饮水。16 只大鼠随机分成 2组： 禁食组（ fasting group） ,正常组（ control group） ,每组 8 只，禁食组大鼠禁食 48 h,正常对照组给予正常饮食。
2. 2 嗅球置管 大鼠用 7% 的水合氯醛 （ 40 mg /kg） 腹腔麻醉，俯卧位，固定在立体定位仪上，头部正中切口，剥离骨膜，使前后囟位于同一水平面。参照大鼠脑图谱，将长 4. 1 cm、内径 0. 3 mm、外径 0. 4mm 的不锈钢带内芯套管植入大鼠左侧嗅球（ anteri-or to bregma at 7. 7 mm; laterial from midline at 1. 6mm; deep from sku at 5 mm） ,牙科水泥结合螺钉固定套管，旋紧套管帽，术后 1 周，创伤完全恢复，开始实验。
2. 3 清醒状态下的荧光金注射 禁食组连续禁食48 h 后，大鼠头部固定，利用微量注射泵经套管注射10% 的荧光黄 2 μl,注射结束，旋紧套管帽。立即置于大鼠食物埋藏箱，并记录大鼠找到全部食物的总时间。
2. 4 埋藏食粒法评价大鼠的嗅觉探索行为 食物埋藏箱用正方形透明塑料盒制成（ 45 cm × 20 cm ×20 cm） ,底部铺 5 cm 厚度的颗粒垫料，垫料经消毒处理，和前期所用垫料相同。食物颗粒埋藏在大约1 cm 深处，位置如 Fig. 1A 所示： 共放置 4 枚食物，记录找到 4 枚食粒的总时间。嗅觉探索行为结束后 6h,立即处死动物。
2. 5 全脑固定与切片 嗅觉探索结束后 6 h,全部大鼠用 7% 的水合氯醛（ 40 mg/kg） 腹腔麻醉，打开胸腔，用 250 ml 生理盐水经左心室快速灌注冲洗，再用 4%多聚甲醛（ PB 配制，pH 7. 4） 250 ml 灌注固定，立即开颅取脑，置人固定液 4℃ 下过夜，再转入20% 蔗糖溶液（ PB 配制，pH 7. 4） 4℃ 下放置，待沉底后，再移入 30% 蔗糖溶液（ PB 配，pH 7. 4） 4℃ 下放置，待沉底后，连续冠状冰冻切片，片厚 30 μm,放置于冷冻保护液内，-20℃保存备用。
2. 6 c-fos 免疫荧光组织化学技术分析梨状皮层神经元活化水平 根据大鼠脑图谱，界定梨状皮层位置，如 Fig. 1B 所示。选取 6 张梨状皮层平面，分别位于 Bregma 1. 92 mm,1. 56 mm,1. 2 mm,0. 84mm,0. 48 mm,和 0. 12 mm,相邻切片之间距离为360 μm.利用漂片法进行 c-fos 的免疫荧光染色，根据常规免疫荧光方法，抗 c-fos 一抗（ Sigma,1∶ 500） ,4℃ ,孵育 24 h,漂洗，偶联 cy3 的二抗，室温下避光孵育 1 h,漂洗，贴片，甘油封片，荧光显微镜观察。
2. 7 荧光显微镜观察 FG 及 C-fos 阳性神经元在梨状皮层的分布 完成 c-fos 免疫荧光染色的脑片置于荧光显微镜下，首先用 530 nm 的激发光显示 cy3,在左侧梨状皮层拍照，位置不变，转换到紫外光，显示 FG,并拍照。每张脑切片在左侧梨状皮层，20 倍物镜下拍两个视野。
2. 8 细胞计数方法 采用盲法计数，分别计数每个视野下 c-fos 阳性细胞，FG 阳性细胞，以及 c-fos 和FG 双阳性细胞。每只动物计数 6 张脑片，12 个视野，最后用每个视野的均值代表阳性细胞的数量。统计学处理： 全部数据用均数 ± 标准差（ x珋 ± s）表示，组内比较采用 t 检验，组间比较采用单因素方差分析。数据处理用 SPSS 17. 0 version 的统计软件进行，P <0. 05 表示差异具有显着性。
结 果
1 饥饿对嗅探索行为的促进作用
利用食物埋藏箱检测饥饿对大鼠嗅觉探索行为的影响，结果发现，饥饿组大鼠找到全部 8 个食粒的时间明显短于非饥饿组，结果见 Fig. 2.这说明饥饿促进了觅食动机，同时也有嗅觉敏化作用，能够很快对食物的嗅觉信号产生记忆。
2 梨状皮层 FG 标记的神经细胞数量变化
为观察饥饿诱导的嗅觉探索行为敏化对嗅球到梨状皮层投射的逆向轴浆运输有何影响，我们采用嗅球注射 FG,观察嗅觉探索行为是否能够促进从嗅球到梨状皮层的轴浆运输效能，FG 注射后 6 h,处死动物，观察在此期间 FG 在梨状皮层神经细胞的聚集情况，间接反应梨状皮层神经细胞的活动状态。结果可见，饥饿组梨状皮层 FG 阳性细胞数量明显增加，和非饥饿组比较差异有显着性。
3 梨状皮层 C-fos 标记的神经细胞数量变化
c-fos 可以标记刺激活动依赖性神经元。饥饿对大鼠嗅觉探索具有促进作用，这一促进作用，仅仅是嗅球层面，还是涉及到高一级神经元，我们利用 c-fos免疫荧光技术，结合半定量，观察梨状皮层在嗅觉探索行为诱导的神经细胞活化方面有无差异，结果发现，饥饿组梨状皮层 c-fos 阳性神经细胞的数量也增加了。
4 梨状皮层 FG+/ C-fos+双标记神经细胞数量的变化
为了进一步观察嗅刺激诱导的活化神经元，是否也存在逆向轴浆运输的增加，我们利用 FG 和 c-fos 双标记技术，结合半定量观察梨状皮层 FG / c-fos双阳性细胞的数量，结果发现，饥饿组双阳性细胞的数量也明显多于非饥饿组，两组之间比较有差异性，结果见 Fig. 5.
讨 论
1 梨状皮层对嗅觉信号的整合
摄食行为是动物最基本也最重要的行为方式，啮齿类动物通过嗅觉系统，完成食物的搜索，对特定食物通过食物的特定气味形成记忆，区别有毒和无毒，因此嗅觉系统对啮齿类动物的生存至关重要，啮齿类动物因此也进化出了发达的嗅觉系统，大鼠的嗅粘膜占鼻黏膜的比例，以及嗅脑占全脑的比例都远远高于人类，嗅粘膜感受气味信号之后，特定的气味分子通过激活一种或是几种 G 蛋白偶联受体，引起神经细胞内 cAMP 依赖性的钠离子通道开放，完成从化学信号向电信号的转换，并进而向上经感觉神经元的轴突，将此信息传导至特定的嗅小球，完成气味信号的空间定位[7].而更为复杂的气味信号分析和整合，则依赖于更高位的中枢结构，如梨状皮层，梨状皮层对嗅觉信号的分析可能和特定嗅觉记忆有关，也可能参与了嗅觉的敏化和钝化过程[8].
我们的研究表明，饥饿导致的嗅觉敏化和对特定食物的嗅觉记忆和梨状皮层关系密切，在饥饿大鼠摄食行为过程，伴随有从嗅球脑到梨状皮层的投射增强，轴浆运输增加，FG 阳性细胞在梨状皮层数量明显增加。
2 嗅觉敏化对梨状皮层的激活
在饥饿状态下，动物对食物的敏感度增加，包括对食物的嗅觉探索，这种嗅觉敏化，一方面可能涉及饥饿状态下和食物气味相关的受体分布会增加[9],另一方面从嗅球到高位皮层的神经激活也会增加，我们的研究发现梨状皮层神经元表达 c-fos 的细胞数量增加，这表明饥饿状态下以嗅觉为导向的觅食行为和梨状皮层神经元活化有密切的联系。
3 梨状皮层可能参与嗅觉探索行为的动机
形成行为的产生除行为执行的器官之外，动机是确保行为发放的关键，脑内有和动机相关的脑区，通过特定的神经环路，决定行为是否发放，何时发放，其中前额皮层（ PFC） 在动机形成中起关键作用，而梨状皮层和 PFC 之间有往返投射，因此梨状皮层可能参与了嗅觉主导的动机形成[10,11].
在过去十余年时间内，对气味分子的识别机制，嗅粘膜到嗅球的投射规律，嗅小球对特定嗅觉信号的空间定位都有了比较深入的了解，但高位皮层对嗅觉信号的整合、调制，如何完成嗅觉记忆及嗅觉的敏化和钝化，依然有很多不清楚的地方。我们的实验发现在饥饿状态下，嗅觉探索行为的敏化和效能提高有大量梨状皮层神经元的参与。
