合谷作为手阳明大肠经的原穴是针灸临床上最常用的穴位之一。近年来,在实验研究中合谷作为代表性穴位也一直是被关注的热点。虽然以往的研究已经初步揭示了合谷穴与神经系统的规律性联系,但是对与合谷相关神经元化学特征的研究还很少。
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种多功能生物活性肽,广泛分布在外周和中枢神经系统,而CGRP的变化经常被作为重要的生化指标显示疼痛的程度和评价不同镇痛方法对疼痛的调节作用。针灸作为经典的外治方法,其镇痛效果已经被大量的临床实践所证实。虽然实验研究表明针灸在镇痛过程中对体内CGRP的水平具有调节作用,但是针灸调节CGRP变化的作用途径还有待进一步解明。
本研究以大鼠“合谷”穴为切入点,采用荧光素594结合霍乱毒素亚单位B(AF594-CTB)示踪技术确定与合谷穴区相关感觉和运动神经元的分布,并结合荧光免疫组织化学技术揭示这些神经元的化学特征,以期从外周到中枢深入了解针刺合谷穴的作用途径和生物学机制。
1、材料与方法
1.1实验动物
清洁级成年雄性Sprague Dawley大鼠4只,体质量(220±20)g,由中国医学科学院动物所提供[实验动物许可证号:SCXK(军)2007-004]。实验过程参照并严格遵守美国国立卫生研究院的《实验动物照料和使用指南》。
1.2主要试剂及仪器
神经示踪剂AF594-CTB(Molecular Probes,美国),异氟烷(九派制药有限公司,中国),小鼠抗CGRP抗体(Abcam,香港),Alexa488荧光素化的山羊抗小鼠二次抗体(Molecular Probes,美国)。微量注射器(10μL,Hamilton Company,美国),小动物麻醉机(VMR,Matrx,Midmark,美国),蠕动泵(BT300-2J,保定兰格恒流泵有限公司,中国),推拉式冰冻切片机(Thermo,Microm International GmbH,德国),尼康光学图像分析仪(Y-IDP,日本)。
1.3AF594-CTB微量注射
在小动物麻醉机控制下用异氟烷对实验动物进行吸入式麻醉。当大鼠进入麻醉状态后,用微量注射器将5μL0.1%AF594-CTB溶液缓慢注入大鼠右侧前肢第2掌骨桡侧的中间点,这一部位相当于人体合谷穴。注射深度约2~3mm,涉及到皮下组织和肌肉。示踪剂注入后,注射器留置1min后缓慢出针。苏醒后的大鼠放回饲养箱中,饲养于室温,并保持12h/12h昼夜节律,自由饮水和摄食。
1.4灌流
示踪剂注入3d后对大鼠经心脏进行灌流。具体操作与我们在以往研究中介绍的方法相同。根据本研究所需要观察的部位,取出颈(C)1至胸(T)5的脊髓和双侧脊神经节,并放置于含4%多聚甲醛和0.1mol/L磷酸缓冲液(phosphate buffered solution,PB,pH7.4)的固定液中后固定2~4h,然后存放于含25%蔗糖的0.1mol/LPB(pH7.4)中,在4℃冰箱里放置到组织完全下沉。其中脊神经节按椎节定位,脊髓节段参照《大鼠脑立体定位图谱》来进行判定。
1.5组织切片的制备
用推拉式冰冻切片机将脊神经节制成矢状切片,将脊髓制成横断切片,厚度为40μm,分别按顺序分为6组置于6孔培养皿内并漂浮在0.1mol/LPB(pH7.4)中,然后放置在4℃冰箱里保存。
1.6观察指标及检测方法
将漂浮的脊神经节和脊髓切片放置于含3%山羊血清、0.5%TritonX-100和0.1mol/LPB(pH7.4)的封闭液中孵育1h,然后移入含小鼠抗CGRP抗体(1∶1000)的稀释液(内含1%山羊血清、0.5%TritonX-100和0.1mol/LPB,pH7.4)并置于摇床上过夜;次日,经0.1mol/LPB清洗3次后,将切片移入含Alexa488荧光素化的山羊抗小鼠二次抗体(1∶500)的上述稀释液中,于室温放置1h后,用0.1mol/LPB清洗3次。然后,再将切片裱贴到阳离子载玻片上。风干后的组织切片上滴加50%的甘油加盖盖玻片后用于观察。整个操作过程中注意避光。示踪和荧光免疫染色标记的神经元采用尼康光学图像分析仪进行观察和拍照。
1.7统计学处理
每个脊神经节的1/2切片和脊髓的1/6切片用于观察和计数,统计数据以均数±标准差(x珔±s)表示,采用SPSS16.0统计软件进行处理。文章中所使用的图片最后经Adobe Photo shop CS2(Adobe Sys-tems,SanJose,CA,美国)进行绘制、标注和编辑。
2、结果
所有实验大鼠AF594-CTB标记到的感觉和运动神经元均出现在示踪剂注入一侧的颈、胸部脊神经节和脊髓,表现为相同的节段和区域性分布模式(图1)。在相应的激发光下,AF594-CTB标记神经元呈红色,CGRP阳性标记呈绿色,由二者共同标记的神经元呈黄色(图2和图3)。
2.1AF594-CTB标记的感觉和运动神经元
与“合谷”穴区相关的感觉神经元以C7脊神经节为中心分布在C5-T1的脊神经节中,其数量依次为C7(300±10.09)>C8(163±16.48)>C6(100±6.32)>T1(45±4.43)>C5(16±2.16)(n=4)。在被AF594-CTB标记的感觉神经元中,按其胞体直径大小分为大(直径>50μm)、中(直径介于30~50μm之间)和小(直径<30μm)3类(图2),在对比观察的200个感觉神经元中分别占3.5%(7/200)、50%(100/200)和46.5%(93/200)。
另一方面,与“合谷”穴区相关的运动神经元以C8脊髓节段为中心分布在C6-T1的脊髓前角后外侧部(图1和图3)。由于脊髓节段之间没有明显的界限,标记到的神经元数没有分节段进行统计。按胞体直径的大小,所标记神经元分为大(直径>25μm)、小(直径≤25μm)两类(图3),二者分属于α和γ运动神经元,在37张脊髓横断切片中观察到的112个运动神经元中它们分别占83.9%(94/112)和16.1%(18/112)。
2.2CGRP标记的感觉和运动神经元以及跨神经节纤维投射
CGRP阳性感觉神经元广泛分布在两侧的脊神经节中。按细胞的大小来看,CGRP阳性感觉神经元以中、小型脊神经节细胞为主(图2)。CGRP阳性运动神经元呈对称性分布在脊髓前角(图3A)。同时可见CGRP阳性神经纤维投射呈对称性集中分布在脊髓后角的1~2层,并散在分布于3~4层(图3A)。
2.3AF594-CTB和CGRP双标记的感觉和运动神经元
通过对比AF594-CTB标记的神经元和CGRP阳性神经元的所在部位,我们看到大部分AF594-CTB标记的感觉神经元呈CGRP阳性表达(图2)。在计数的200个被AF594-CTB标记的感觉神经元中,有147个呈CGRP阳性表达,占总数的73.5%。在脊髓前角,所有AF594-CTB标记的运动神经元均表现为CGRP阳性(图3)。
3、讨论
本项研究的主要特色是有效地将神经示踪技术与荧光免疫组织化学技术结合运用于针灸形态学研究。它不仅揭示了与合谷穴区相关的感觉和运动神经元在脊神经节和脊髓的分布特征,而且进一步明确了这些神经元所具有的特定化学表达。我们最近的研究表明,AF594-CTB神经示踪技术以其高敏感、荧光持久和激发光集中等特征已经成为在针灸形态学研究中追踪穴位相关神经元的有效方法。通过本研究我们不仅又一次验证了AF594-CTB良好的神经元标记效果,而且将其与CGRP荧光免疫组织化学技术结合使用,同样标记出清晰的双标记神经元,进而提示AF594-CTB示踪技术也可能与其它类抗原物质结合用于研究穴位相关神经元的特定化学特征。从方法学上来看,二者配合使用可能成为今后针灸形态学研究的重要手段。
以往关于“合谷”穴的形态学研究虽然从不同的侧面揭示了与“合谷”穴相关神经元的规律性分布,但是由于所采用示踪方法的不同所得到的标记结果也存在差异。本研究在穴区微量注入的AF594-CTB具有注入后局部扩散范围小的特点,所以标记结果会更准确地反映与标记穴位相对应神经元的分布部位。从大体解剖上看,合谷穴区所在区域的神经支配主要源于臂丛神经,以C6~C8分支为主。我们的研究结果与上述观点相一致,并进一步在细胞水平上明确了与“合谷”穴区相关的感觉和运动神经元在神经系统中呈节段和区域性分布的特征。这一结果有助于更好地理解针刺合谷穴所激发的信号从外周向中枢传导的确切途径。
从外周组织来看,大量的CGRP阳性神经纤维分布在皮下、毛囊、皮脂腺和血管周围,与痛觉传导及调制有关。这些组织同样是构成穴位局部形态结构的重要成分。在脊神经节,CGRP阳性神经元经外周的化学和温热性等刺激后可以被激活,并参与向位于脊髓后角的痛性和内脏感觉性神经元的信号传递。这一途径可能也是针灸调节CGRP释放的重要途径。以往研究表明,针刺可引起血浆、脊髓背角、脊髓灌流液和局部组织中CGRP的变化,其中低频电针刺激可使脊髓灌流液中CGRP放射免疫活性的含量下降,而高频电针刺激则可使其含量升高。说明不同的针刺刺激可能引起机体内CGRP表达的上调或下调。有鉴于与“合谷”穴相关神经元中绝大部分感觉神经元和全部运动神经元均表现为CGRP阳性这一形态学证据,我们推测针刺过程中所激发的信号可能对CGRP的合成和释放发挥相应的调节作用。
CGRP不仅在运动神经终末与乙酰胆碱共存参与调节各种常见神经递质的释放,而且在感觉神经系统中也与P物质、血管活性肠肽等神经肽类物质共同参与各种感觉传导。这些物质都与针灸的作用机制密切相关。针灸是否可以通过对CGRP的调节激发更多的生物学效应还有待进一步探讨。
总之,本研究综合运用AF594-CTB示踪技术和CGRP免疫荧光组织化学技术成功地揭示了与大鼠“合谷”穴区相关感觉和运动神经元的分布特征及其特定的化学表达。这些结果为我们从神经通路和神经化学表达方面深入研究针灸效应的神经生物学机制提供了重要的形态学依据。
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