骨关节炎发病机制及治疗措施的研究中经常用到细胞学水平的研究，观察软骨细胞的形态结构成为实验中的一种重要的方法。在过去的研究中[1 -3]，人们对软骨大体标本的特殊染色技术已经进行了大量的改良，并应用于骨关节炎的研究中，取得了良好的效果，但是对于软骨细胞水平的染色技术发展缓慢，以至于无法用简便的方法对细胞形态进行观察，对研究造成了不便。本研究利用C57BL /6J 小鼠进行软骨细胞的原代培养，对软骨细胞爬片进行 HE 染色、番红 O-固绿双染色、SA-β 半染糖苷酶衰老染色及 II 型胶原免疫组化染色，探讨这几种染色技术在软骨细胞爬片中的染色规律及应用价值，为骨关节炎细胞水平研究提供便利的条件。
1 材料和方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 实验动物及实验环境： 出生 7 d 内的健康SPF 级 C57BL /6J 小鼠 12 只【动物合格证号： No:44007200018611】，雌雄不限，体重（4 ± 1） g,实验用小鼠够购买自广东省医学实验动物中心【生产许可证号： SCXK（粤） 2013-0002; 使用许可证号： zSYYX（粤） 2013-0002】，饲养于北京大学/香港科技大学医学中心深圳医院实验动物中心【使用许可证号：SYXK（粤） 2010-0106】SPF 级屏障区域的 PVC 鼠笼内，持续过滤通气，自由饮食，清洁饮水，每日保持12 h 光照 / 黑暗循环。实验流程和小鼠处理均遵循实验动物管理规范条例。
1. 1. 2 实验仪器： 高压灭菌器（日本 Hirayama 公司） ,用于实验材料的灭菌； 电热鼓风干燥箱（中国精宏公司） ,用于灭菌材料的干燥； 纯水机（美国Millipore 公司） ,用于试剂配制； 恒温水浴锅（上海百典仪器设备有限公司） ,用于试剂复温； 生物洁净工作台（中国苏净公司） ,用于实验操作； 微量移液枪（Thermo fisher） ,用于试剂配制及细胞培养； 高速冷冻离心机（德国 Sigma 公司） ,用于细胞离心； 培养箱（德国 Themo 公司） ,用于细胞培养； 光学显微镜（德国 Leica 公司） ,用于细胞观察及拍照。
1. 1. 3 实验试剂： II 型胶原一抗、goat anti-rabbitIgG H&L （Cy3 ? ） preadsorbed 9 购自 Abcam 公司，生物素化兔抗山羊 IgG、SABC-POD、DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，fast greensolution、safranin O solution 购自 Scytek 公司，细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司，Collagenase、胰 酶 购 自 Worthington 公 司，改 良 型RPMI-1640 培养基购自 HyClone 公司，青 / 链霉素溶液购自伊科赛公司，胎牛血清购自 Life 公司，0. 4%台盼蓝溶液购自广州晶欣公司，二甲苯、无水乙醇、30% H2O2购自广州化学试剂厂，苏木素购自广州速聚生物有限公司，中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司，伊红 Y 购自行知生物科技有限公司。
1. 1. 4 试剂配制： 软骨细胞培养液： 改良型 RPMI-1640 培养基 90 mL,胎牛血清 10 mL; 4% II 型胶原酶消化液： collagenase 粉末 4 g,PBS 96 mL.
1. 2 实验方法
1. 2. 1 小鼠膝关节软骨细胞的分离培养： 取出生 7d 以内的 C57BL /6J 小鼠 12 只，全部实验动物气管窒息法处死，置于 75%酒精中浸泡 5 min,取出小鼠用碘伏消毒膝关节处； PBS 漂洗 3 遍各 3 min; 将组织块剪切成 1 mm3; 加入含有双抗的 4% II 型胶原酶中于 37℃、5% CO2培养箱中消化 4 h; 充分吹打细胞消化液，200 目过滤收集滤液； 1 500 r/min 离心5 min,无菌 PBS 清洗并离心 2 次； 弃上清液加入 6mL 完全培养基重悬细胞沉淀，接种至培养瓶中； 于37℃ 、5% CO2培养箱中培养观察，1∶ 3比例传代，取3 代以内的细胞进行实验。
1. 2. 2 软骨细胞爬片的制作： 准备多聚赖氨酸溶液浸泡后的 24 孔板大小的盖玻片于超净台中晾干；5 代以内的软骨原代细胞消化后台盼蓝计数，配制成 1 × 105/ mL 细胞悬液； 24 孔板中加入少许培养基，将细胞悬液均匀滴到玻片上； 常规培养 6 h 等到细胞贴壁后，再滴加培养基布满整个板底，继续培养至 24 h.
1. 2. 3 软骨细胞的鉴定： 将分离取得的细胞 1 ×105接种到细胞爬片，静止贴壁； 吸去上清培养基；孵育一抗，anti-collagen II antibody,37℃，1 h; PBS 轻微洗涤 3 次； 孵育 goat anti-rabbit-Cy3,37℃ 1 h; PBS轻微洗涤 3 次； 孵育 Hoechst 33258,室温 15 min.
1. 2. 4 细胞爬片的 HE 染色： 4% 多聚甲醛固定细胞爬片 20 min,流水冲洗 3 次各 2 min,苏木素滴染2 min,自来水返蓝 2 min,80% 酒精急洗，伊红滴染30 s.
1. 2. 5 细胞爬片的番红 O-固绿双染色： 4% 多聚甲醛固定细胞爬片 20 min,流水冲洗 2 min × 3,苏木素染核 2 min,自来水返蓝 2 min,番红 O 染液滴染30 min,95% 乙醇分化 10 s,自来水洗 10 s,60℃ 预热固绿滴染 1 min,蒸馏水急洗一次，番红 O 染液复染30 min,95% 乙醇分化 5 s,自来水冲洗 10 s.
1. 2. 6 细胞爬片的 SA-β-gal 半乳糖苷酶衰老染色： ①染色工作液根据碧云天细胞衰老 β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书配制： β-半乳糖苷酶染色液 A10 μL,β-半乳糖苷酶染色液 B 10 μL,β-半乳糖苷酶染色液 C 930 μL,X-Gal 溶液 50 μL,混合均匀。②β-半乳糖苷酶染色固定液固定 30 min,PBS 洗 5 min× 3,染色工作液覆盖爬片 37℃ 过夜。
1. 2. 7 细胞爬片的 II 型胶原免疫组化染色： 4% 多聚甲醛固定细胞爬片 20 min,流水冲洗 2 min × 3;烤片 3 min; 蒸馏水冲洗 2 次； 抗原修复； PBS 冲洗 3次； 滴加过氧化物酶阻断剂； PBS 液冲洗 3 次； 滴加非免疫性动物血清； 滴加 II 型胶原一抗； PBS 液冲洗3 次； 滴加生物素标记的二抗； 滴加 SP 溶液； 滴加2 滴新鲜配制的 DAB 溶液。
2 结果
几种特殊染色方法观察软骨细胞形态结构比较见表 1.
2. 1 倒置显微镜下软骨细胞形态常规消化细胞，并用含 10% FBS 的 1640 培养基培养关节软骨细胞，分别与 0、3、7 d 于显微镜下观察细胞形态（图 1 见彩插 6） .0 d 软骨细胞均匀分布在培养瓶底，处于待贴壁状态； 3 d 软骨细胞完全贴壁，呈梭形、三角形或多角形； 7 d 软骨细胞融合，铺满培养瓶瓶底。
2. 2 II 型胶原免疫荧光鉴定软骨细胞II 型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用 II 型胶原的免疫荧光对软骨细胞进行鉴定。荧光标记后，软骨细胞细胞核呈圆形紫蓝色荧光，II 型胶原呈条带状红色荧光（图 2 见彩插 6） .
2. 3 HE 染色观察软骨细胞苏木素可与核酸等酸性物质结合显示蓝色，而伊红可与碱性蛋白物质结合显示出红色，进而将细胞的形态结构区分开来。染色后我们可以看到软骨细胞的细胞核呈蓝色，为圆形或者卵圆形，细胞质呈粉红色，三角形或梭形（图 3 见彩插 6） .
2. 4 番红 O-固绿双染色观察软骨细胞番红 O 是碱性染料可与核酸结合显示红色，固绿是酸性染料可与蛋白结合将显示蓝色或者绿色。染色后我们可以看到细胞核呈粉红色，但部分颜色被细胞质染色所覆盖，细胞质呈蓝绿色（图 4 见彩插 6） .
2. 5 SA-β-gal 半乳糖苷酶衰老染色观察软骨细胞细胞衰老后，溶酶体中 β 半乳糖苷酶的表达升高，表达量越高，细胞所染颜色越重，衰老程度也越严重。染色后我们能够清楚的看到细胞质绿染且颜色深浅不一，细胞核无法辨别（图 5 见彩插 6） .
2. 6 II 型胶原免疫组化染色观察软骨细胞II 型胶原免疫组化染色可以特异性的定位 II型胶原的位置，苏木素复染后可以显示细胞核的位置。染色后我们可以看到 II 胶原表达出呈现棕黄色，而细胞核呈现紫色（图 6 见彩插 6） .
3 讨论
软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，被包埋在软骨基质中，它可以感受机体周围的变化，维持细胞外基质的平衡，其分泌的细胞外基质主要是糖蛋白和 II 型胶原[4].软骨细胞的细胞核较小，呈圆形或卵圆形，有一到数个核仁，细胞可呈三角形、梭形或多角形。在软骨组织中，越靠近周边的软骨细胞越幼稚，常单个分布； 越靠近中央的软骨细胞越成熟，常多个聚集在一起[5].骨关节炎（OA） 与关节软骨细胞的衰老和凋亡密切相关，主要表现为进行性的软骨关节破坏，本质上是一种生物学重建过程[6].随着我国老龄化进程的加剧，该病已经成为影响老年人健康的主要慢性退行性病变之一，但是对其发病机制仍然知之甚少，因此对该病的研究成为近年来的热点。
目前对于动物标本的特殊染色技术发展较快，在骨关节炎领域的研究中应用广泛。细胞学水平的研究与动物水平的研究同等重要，但是细胞染色技术发展较慢，在骨关节炎研究领域应用较少，这一方面是因为细胞染色与组织标本相比染色困难，另一方面是由于电镜等技术的发展代替了染色对细胞结构的观察。但是，对于软骨细胞的特殊染色仍有其优点，比如操作简便、价格低廉、不需要特殊的仪器设备等，这对于没有电镜等特殊设备的实验室仍然是一个好的选择。
本课题组在进行骨关节炎的研究过程中，根据研究的需要对软骨细胞的 HE 染色、番红 O-固绿双染色、SA-β-半乳糖苷酶衰老染色和 II 型胶原免疫组化染色条件进行了探究，取得了良好的效果。
苏木素-伊红染色技术是病理技术中最经典的染色方法，是由 Waldeyer 于 1863 年首先提出来的，一直沿用至今。常规的 HE 染色是根据苏木素和伊红两种染料对酸碱性物质的亲和性不同而着色，苏木素可与核酸等酸性物质结合，从而使细胞核呈现蓝色，而伊红可以与细胞质中的碱性蛋白物质结合，显示出红色，进而将细胞的形态结构区分开来[7].我们可以看到，在软骨细胞爬片的 HE 染色中，细胞核与细胞质结构清楚，单个细胞的轮廓也清晰可辨，是一种观察细胞形态较好的染色方式。
番红 O-固绿双染色中，番红 O 是碱性染料可与核酸结合将细胞核红染，固绿是酸性染料可与蛋白结合将细胞核染成蓝色或者绿色[8].在软骨细胞爬片中，可以分辨出细胞核与细胞质的结构，但分辨率不如 HE 染色清楚，这种分辨情况与软骨组织中两种染色的分辨情况正好相反，这可能是由于固绿与番红 O 相比更容易着色，而绿色可以覆盖部分红色使得结构相对不太清晰。但是，该染色在软骨细胞或软骨组织中是一种特异性的染色，其使用率较高，通过我们在软骨细胞爬片上的实验也得到了预期的效果，可以在软骨细胞中加以应用。
β-半乳糖苷酶是检验细胞衰老的一种特异性的标志酶，由 Dimri 等[9]在 1995 年首次提出，衰老软骨细胞在 pH 6. 0 时会表现出溶酶体 β-半乳糖苷酶活性的升高，衰老的软骨细胞可以表达此酶，通过对不同阶段的软骨细胞的衰老染色情况进行分析，可以得到软骨细胞的衰老情况，从而确定不同状态下软骨细胞老化的速度及程度[10].通过实验结果我们可以看到，由于 β-半乳糖苷酶表达量的升高，细胞质被染成绿色，并且当细胞衰老程度越严重时，绿色越明显，而未衰老的细胞则无此染色。该染色在反应细胞的形态结构方面不清楚，无法分辨细胞核与细胞质。
II 型胶原是软骨细胞分泌的特异性物质，通过II 型胶原免疫组化染色可以对软骨细胞进行特异性的定位，对 II 型胶原的分布及定量作用明显，通过苏木素的复染，可以分辨其余细胞，作用很大。我们通过染色发现，II 型胶原表达处呈现棕黄色，而通过苏木素的复染，细胞核呈紫色，从而清晰的分辨出细胞核与细胞质。由于 II 胶原只是细胞分泌的细胞外基质中的部分成份，该染色无法显示细胞质中的其他成份，所以单个细胞的形态不是很清楚。
该染色在 II 型胶原特异性的定位及定量作用比较明显。
综上所述，各种染色方法各有优缺点，但在软骨细胞形态观察方面，HE 染色和番红 O-固绿双染色分辨细胞比较清楚，可以获得更加全面的信息，尤其以 HE 染色最佳； SA-β-gal 半乳糖苷酶衰老染色对于衰老软骨细胞的数量及软骨细胞衰老程度的检测用处较大； II 型胶原免疫组化染色则可以用于 II 型胶原的定位与定量。我们在使用软骨细胞进行研究时，可以综合采用多种染色方法。
参考文献：
[1] 黄云梅，陈文列，黄美雅，等。 多种特殊染色法在骨关节炎组织形态学研究中的应用比较 [J]. 中国比较医学杂志，2011,21（5） : 45 - 49.
